Chelex-100提取DNA準則

來自干燥血斑的瘧原蟲DNA是通過在5%Chelex 100的懸浮液中加熱樣品來提取的。在堿性懸浮液中加熱到近100oC會破壞細胞膜并分解蛋白質(zhì)，包括熱不穩(wěn)定的酶，而Chelex 100（一種離子螯合劑）通過滅活核酸酶和螯合可能破壞寄生蟲DNA的重金屬來限制DNA的破壞。這種方法使得獲得適合PCR的寄生蟲DNA成為可能。它是一種快速，廉價，有效的DNA提取方法。由于這是PCR過程的第一步，因此保持無菌技術(shù)以防止提取的DNA污染非常重要。

Chelex-100提取DNA所需材料和設(shè)備

1.5毫升微量離心管

1-20 μl 單通道自動移液器

100-200μl單通道自動移液器

1000 μl 單通道自動移液器

上述移液器的過濾器移液器吸頭

細筆尖記號筆

圓珠筆

紙巾或濕巾

蒸餾水

磷酸鹽緩沖液 (PBS)

燒杯或洗瓶中的漂白劑 (5%)

燒杯或洗瓶中的蒸餾水

燒杯或洗瓶中的乙醇 (70 %)

Chelex-100 樹脂

剪刀或 1/8 英寸打孔器（如果使用打孔器，請加上備用濾紙）

定時器

微量離心機

加熱塊或 56 oC 水浴

沸點水?。?6 oC 或以上）

渦流

Chelex-100提取DNA程序步驟

要記住的要點：

• 確保在開始手術(shù)前徹底清潔剪刀，在

• 在切割濾紙之間和程序結(jié)束時。 不干凈的剪刀

• 可能導(dǎo)致樣品交叉污染和質(zhì)量差的結(jié)果。

• ?確保移液器吸頭質(zhì)量高、無菌且不含核酸內(nèi)切酶。

• 請勿觸摸移液器吸頭。

• 確保定期校準和清潔移液器。

1. 打印一份 PCR 工作表并記錄每個待測 DBS 的樣本 ID單獨的編號行。

2. 收集所有必需的用品。注意。 如果樣品已在 +4 oC 或 -20oC 下儲存，則必須將它們帶到房間樣品袋開封前的溫度。

3. 收集所有必需的用品。通過加入蒸餾水（例如 0.2 g Chelex 和 10毫升蒸餾水）。注意： Chelex 試劑應(yīng)根據(jù)需要每天新鮮制作。

4. 將剪刀或打孔器浸入乙醇 (70%) 中并通過火焰。

5. 標記適當數(shù)量的 1.5 ml 微量離心管（蓋上兩個蓋子和試管的一側(cè)）帶有工作表編號和樣品 ID。

6. 切割 2-3 塊 3 mm x 3 mm 或打孔 3 mm 圓盤（可容納約 3-5 μl干血）從濾紙中取出，放入相應(yīng)的 1.5微量離心管或 96 孔微量滴定板的孔。

注意： 按照步驟 5 中的詳細說明清潔每個樣品之間的剪刀。用干凈的濾紙沖孔 3 次。

7. 加入 1 毫升 PBS。注意： 確保濾紙浸泡在緩沖液中。

8. 室溫孵育 10 分鐘。

9. 14,000 rpm 離心 2 分鐘，用干凈的每個樣品的移液器吸頭。

10. 加入 1 毫升 PBS

11. 14,000 rpm 離心 2 分鐘，用干凈的每個樣品的移液器吸頭。

12. 加入 150 微升無核酸酶水。

13. 加入 50 微升 20 % Chelex。

14. 99 oC 孵育 10 分鐘。

15. 14,000 rpm 離心 1 分鐘。

16. 將上清液儲存在 +4oC 以用于 PCR。注意：如果樣品儲存時間超過一天，請將上清液轉(zhuǎn)移到新鮮的微量離心管并儲存在 -20 oC。