突觸連接的密集重建需要整個大腦的高分辨率電子顯微鏡圖像和工具來有效地追蹤整個神經(jīng)元。

為了生成這樣的資源，近日，Herwig Baier團隊通過電子顯微鏡對幼年斑馬魚大腦進行了切片和成像，并重建了一個由208個參與視覺運動處理的神經(jīng)元組成的網(wǎng)絡(luò)。Nature Method 雜志發(fā)表了他們最新的研究成果，名為“Automated synapse-level reconstruction of neural circuits in the larval zebrafish brain”。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的信息處理是由相互連接的神經(jīng)元進行的。突觸是該網(wǎng)絡(luò)中通信的關(guān)鍵部位，只能通過電子顯微鏡 (EM) 識別特定的一對神經(jīng)元。之前有研究嘗試重建有機體的神經(jīng)系統(tǒng)回路，例如秀麗隱桿線蟲，創(chuàng)建的連接圖對于研究神經(jīng)回路至關(guān)重要。與此同時，已經(jīng)為無脊椎動物物種生成了大腦的 EM 重建。到目前為止，還沒有為脊椎動物提供具有可比分辨率的全腦數(shù)據(jù)集。

以突觸分辨率將功能與結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來可能涉及記錄神經(jīng)元活動，例如，通過雙光子 (2P) 鈣成像，然后用體積 EM (vEM) 重建潛在的細胞連接。幼年斑馬魚 (Danio rerio) 特別適合這種方法。在受精后 5?天，幼年斑馬魚大腦的大小與成年果蠅相當：從頭端到尾部700?μm，最大寬 450?μm，從背側(cè)到腹側(cè)表面最大 320?μm（圖1a，b）。為幼年斑馬魚生成了數(shù)千個單神經(jīng)元形態(tài)和區(qū)域到區(qū)域（中尺度）接線圖的全腦目錄，這些數(shù)據(jù)提供了對 vEM 跟蹤的合理性檢查，尤其是遠程預(yù)測。

圖1.頂骨前2P鈣成像和全腦幼蟲SBEM數(shù)據(jù)集采集。

光流神經(jīng)元及其連通性的追蹤

圖2顯示作者將在功能記錄之后拍攝的高分辨率 2P z-stack與 vEM stack坐標（圖2a-d）對齊，進一步建立了功能識別的細胞和 vEM 數(shù)據(jù)集中的細胞之間的對應(yīng)關(guān)系。

他們選擇的對應(yīng)點，從大規(guī)模結(jié)構(gòu)（心室和血管）到更精細的結(jié)構(gòu)（例如，個體軀體），確定了重建細胞之間的突觸，在這 208 個神經(jīng)元之間產(chǎn)生了總共 1,079 個突觸接觸（圖2i，j）。

圖2.功能特征的頂葉前神經(jīng)元的映射和EM重建。

最后，作者將 Max Planck Zebrafish Brain Atlas（mapzebrain，http:/mapzebrain.org）注冊到他們的 vEM 數(shù)據(jù)集。mapzebrain地圖集提供了參考幼蟲大腦（“標準大腦”）中 112 個區(qū)域的帶注釋碼。作者根據(jù)兩個數(shù)據(jù)集中的體細胞和神經(jīng)細胞區(qū)域的分布進行了映射（圖3a，b）。這將 EM 和光學顯微鏡 (LM) 坐標系帶入配準（圖3c）。

圖3. LM Atlas和vEM stack的注冊。

自動分割和人工校對

作者使用 FFN22 首先創(chuàng)建基礎(chǔ)分割，最小化合并錯誤，然后將其聚合以減少分割錯誤，同時將合并錯誤保持在可接受的水平（圖4a，b）。

生成的單元格或單元格片段既顯示在 3D 視圖中，也顯示在覆蓋在原始數(shù)據(jù)上的切片視圖中。在頂蓋神經(jīng)元樣本（n?=?18）中，每個細胞平均需要 2.8 次和 98.5 次交互（鼠標點擊）來校正合并和分裂錯誤（參見圖4c中的分裂說明）。

圖4.自動神經(jīng)突分割。

頂葉SINs的突觸伙伴

為了對校對工作流程進行基準測試，作者首先追蹤一個神經(jīng)元，在頂蓋的 SIN 中隨機選擇，以及它的所有突觸前和突觸后伙伴（SIN1；圖5）。SIN 是一類廣泛參與處理視覺刺激的頂蓋細胞。由此產(chǎn)生的重建揭示了典型的 SIN 形態(tài)：在纖維層和灰色表面（SFGS3/4 層，圖5a）中有一個廣泛的單層樹枝狀結(jié)構(gòu)。作者沿著 SIN1 的所有分支搜索突觸前和突觸后位點（圖5a）。

總的來說，他們確定了 340 個突觸（輸入：155，輸出：185）。一些 SIN 神經(jīng)突具有混合的軸突和樹突特征，突觸前和突觸后位點通常非常接近（圖5a，b）。從這些位點開始，追蹤了所有的突觸伙伴（圖5c-g）。

接下來，作者追蹤了另一個 SIN（SIN2）的所有伙伴細胞（圖5f-h 中的橙色）。SIN2 于同一頂蓋下層，形態(tài)與 SIN1 相似。輸入突觸來自 RGC (92個)、PVIN (45個)、后腦 (5個)、pretectum (3個) 和其他 SIN (3個，其中 SIN1)。

總之，這項工作提供了一個 SIN 網(wǎng)絡(luò)及其所有突觸伙伴。

圖5.重建 SIN 及其合作伙伴。

結(jié) 論

本文作者描述了一個數(shù)據(jù)集，其中包含幼年斑馬魚大腦的 EM 體積，通過自動生成的 121,000 個細胞核圖、突觸接觸位置和神經(jīng)突的提議分割來增強。該分辨率適用于突觸規(guī)模的重建。大約0.058?mm3的EM體積由12.5 teravoxels表示（近29,000個切片，每個25?nm厚，以14?×?14?nm2像素大小成像）。作者開發(fā)的計算工具可以從這些數(shù)據(jù)中直接提取數(shù)據(jù)集中的連接信息。

斑馬魚系統(tǒng)另一個值得追求的方向是發(fā)育和成長。雖然目前的數(shù)據(jù)集包含一個幼年的大腦，但即使是成年斑馬魚的一百倍大的大腦仍然可以進行全腦 EM 重建。作者預(yù)計技術(shù)進步將使斑馬魚（包括突變體和疾病模型）中生成連接組成為未來的一項常規(guī)任務(wù)。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41592-022-01621-0

參考文獻：

Svara, F., F?rster, D., Kubo, F. et al. Automated synapse-level reconstruction of neural circuits in the larval zebrafish brain. Nat Methods 19, 1357–1366 (2022).

編譯作者：Ayden（brainnews創(chuàng)作團隊）

校審：Simon（brainnews編輯部）

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