卵巢癌是女性癌癥死亡的常見原因，占癌癥死亡的5%。由于其早期無癥狀，大多數(shù)卵巢癌在晚期才被診斷出來，且出現(xiàn)腹腔轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，癌癥轉(zhuǎn)移是癌癥致死的主要原因。轉(zhuǎn)移性卵巢癌與機體復(fù)發(fā)和耐藥密切相關(guān)，對卵巢癌轉(zhuǎn)移的透徹了解被認為有助于提高癌癥治愈率，但仍未得到很好的闡明。

卵巢癌轉(zhuǎn)移研究的一個重要方面是驅(qū)動分子的鑒定。近日，青蓮百奧合作客戶浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦科醫(yī)院婦科腫瘤科呂衛(wèi)國團隊在《Oncogene》上發(fā)表了一篇題為“MAP4K4 promotes ovarian cancer metastasis through diminishing ADAM10-dependent N-cadherin cleavage.”的研究文章。在這項研究中，作者確定MAP4K4是卵巢癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵驅(qū)動因素。

標題：MAP4K4 promotes ovarian cancer metastasis through diminishing ADAM10-dependent N-cadherin cleavage.

期刊：Oncogene（IF =8.756）

時間：2023.03

背景

MAP4K4是一種與Ste20激酶家族相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可促進卵巢癌細胞SKOV3的遷移。據(jù)報道，MAP4K4在局灶性粘連動力學(xué)、胰腺腫瘤發(fā)生、宮頸癌的化學(xué)敏感性、肝細胞癌的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移以及肺腺癌的腫瘤維持中均有核心作用。然而，破譯MAP4K4在卵巢癌中的遷移作用的詳細機制和更直接的證據(jù)仍然缺乏。

研究思路

通過比較卵巢癌原發(fā)性和轉(zhuǎn)移組織的基因表達譜進行了無偏倚的高通量篩選，發(fā)現(xiàn)與卵巢癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的最重要的激酶MAP4K4，并進行底物磷酸化蛋白的驗證（青蓮百奧提供服務(wù)）。確定MAP4K4是卵巢癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵驅(qū)動因素。通過體內(nèi)異種移植小鼠模型腹腔注射MAP4K4抑制劑觀察卵巢癌的轉(zhuǎn)移抑制情況確定MAP4K4在卵巢癌轉(zhuǎn)移中的癌癥促進作用及其作為治療靶點的潛力。

研究內(nèi)容

1、MAP4K4的高表達與卵巢癌患者的腹膜轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)

作者通過對卵巢癌原發(fā)腫瘤和腹膜轉(zhuǎn)移腫瘤進行了轉(zhuǎn)錄組測序。與原發(fā)組織相比，MAP4K4在轉(zhuǎn)移組織中的表達水平更高。由于轉(zhuǎn)移導(dǎo)致不良預(yù)后，作者接下來旨在研究MAP4K4與卵巢癌患者預(yù)后之間的相關(guān)性。Kaplan-Meier分析顯示，原發(fā)腫瘤中MAP4K4水平高的患者預(yù)后明顯較差。此外，來自TCGA、GSE19829、GSE26193、GSE27651、GSE26712和GSE3061的數(shù)據(jù)顯示，MAP4K4的高表達與預(yù)后不良有關(guān)，與作者的隊列數(shù)據(jù)一致。作者還注意到，MAP4K4的表達與CA125的血清表達和腹水體積呈正相關(guān)。轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)證明了與原發(fā)腫瘤相比，轉(zhuǎn)移性腫瘤具有不同的基因表達譜。作者推斷MAP4K4是腹膜轉(zhuǎn)移過程中表達最多的激酶，是卵巢癌轉(zhuǎn)移形成的重要驅(qū)動因素。

2、MAP4K4依賴其激酶活性促進卵巢癌癥細胞遷移、侵襲和粘附

為了研究MAP4K4在卵巢癌體外進展中的生物學(xué)功能，作者采用了幾種細胞系。通過qRT-PCR和免疫印跡法檢查MAP4K4在卵巢癌細胞系中的表達。結(jié)果顯示，MAP4K4在SKOV3中表達較高，在A2780細胞中表達較低。首先用三種siRNAs來下調(diào)MAP4K4在SKOV3細胞中的表達，由于siRNA1和siRNA2對MAP4K4的敲除程度較高，因此選擇它們進行進一步研究。CCK8和EdU檢測數(shù)據(jù)的結(jié)果顯示，MAP4K4敲除并不影響細胞增殖，用菌落形成試驗證實了這一結(jié)果。

為了評估MAP4K4對卵巢癌細胞遷移和侵襲能力的影響，作者進行了傷口愈合和轉(zhuǎn)孔實驗，當MAP4K4被敲除時，觀察到傷口愈合明顯延遲。用GNE-495（一種MAP4K4的特異性抑制劑）處理細胞時，傷口愈合也明顯延遲。為了模擬MAP4K4對卵巢癌細胞粘附行為的影響，進行了粘附測定，結(jié)果顯示MAP2K4敲低能夠降低癌細胞的粘附性能。為了進一步研究MAP4K4的效果，通過使用CRISPR / Cas9基因編輯產(chǎn)生了具有MAP4K4敲除（KO）的SKOV9細胞系。與母體細胞相比，MAP4K4-KO細胞的遷移能力明顯下降。過量表達MAP4K4 WT或激酶活性突變體，能夠改善A2780細胞的遷移缺陷。這些結(jié)果共同表明，MAP4K4的促遷移作用依賴于其激酶活性。

3、MAP4K4激活上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化穩(wěn)定N-鈣粘蛋白

為篩選確切的轉(zhuǎn)移相關(guān)生物學(xué)過程，進行了GSEA分析，該分析源于轉(zhuǎn)移性腫瘤與原發(fā)性腫瘤表達水平的比較分析。其中，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）特征在轉(zhuǎn)移組織中富集最顯著。TGF-β（轉(zhuǎn)化生長因子-β）通過誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化作為腫瘤促進因子。為了驗證EMT過程的上調(diào)，使用TGF-β處理誘導(dǎo)SKOV3細胞從上皮表型到間充質(zhì)樣表型，細胞狀態(tài)明顯發(fā)生轉(zhuǎn)變。后續(xù)作者發(fā)現(xiàn)EMT表型可能由MAP3K4的過表達誘導(dǎo)，就進一步研究了MAP4K4對其表達的影響，結(jié)果顯示N-鈣粘蛋白在MAP4K4敲低或敲除后顯著降低，證明更多的應(yīng)激纖維形成和細胞表面更多的細胞偽足，類似于TGF-β處理的效果。

4、MAP4K4通過ADAM10依賴性方式穩(wěn)定N-鈣粘蛋白

先前研究報道金屬蛋白酶，包括基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和ADAMs可介導(dǎo)N-鈣粘蛋白的脫落。為了研究N-鈣粘蛋白在SKOV3細胞中的表達水平是否受金屬蛋白酶的調(diào)節(jié)，作者檢測了SKOV3細胞中各種MMPs和ADAMs的表達水平。其中MMP1、MMP7、ADAM10、ADAM15、ADAM17和ADAM19高表達。進一步研究這些蛋白質(zhì)對N-鈣粘蛋白穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)敲低ADAM10，顯著阻斷了MAP4K4敲低時N-鈣粘蛋白的減少。ADAM10是一種跨膜金屬蛋白酶，可釋放一系列細胞表面蛋白，包括Notch、Eph和N-鈣粘蛋白。同時免疫沉淀結(jié)果表明，在MAP4K4敲除后，ADAM10與N-鈣粘蛋白的結(jié)合增強。上述結(jié)果表明，MAP4K4可能通過ADAM10依賴機制穩(wěn)定N-鈣粘蛋白。

5、MAP4K4和ADAM10互作

通過生成一系列MAP4K4和ADAM10的結(jié)構(gòu)域缺失突變體來進行定位分析MAP4K4和ADAM10之間的相互作用。結(jié)果表明，MAP4K4通過其CNH結(jié)構(gòu)域與ADAM10相互作用，因為ADAM10-HA與MAP4K4 CNH結(jié)構(gòu)區(qū)缺失突變體的結(jié)合顯著降低。由于MAP4K4屬于Ste20激酶家族，推斷ADAM10可能是MAP4K4磷酸化的底物。為了驗證這一觀點，使用磷酸標記凝膠來解析磷酸-ADAM10蛋白；用ADAM10抗體進行免疫沉淀測定，用抗泛磷酸絲氨酸/蘇氨酸抗體檢測ADAM10的磷酸化水平。觀察到一致的結(jié)果。當MAP4K4被抑制時，ADAM10磷酸化降低。結(jié)果表明ADAM10與MAP4K4相互作用并被磷酸化。

6、ADAM10的活性被MAP4K4介導(dǎo)的S436磷酸化抑制

為了驗證MAP4K4介導(dǎo)ADAM10發(fā)生磷酸化，F(xiàn)lag標記的MAP4K4野生型（WT）、激酶結(jié)構(gòu)域缺失突變體、激酶活性突變體、激酶非活性突變體和HA標記的ADAM10被過表達，研究它們對ADAM10磷酸化的影響。當野生型MAP4K4過表達時，ADAM10的磷酸化增加，并且通過活性形式的MAP4K4的過表達顯著增強。相反，沒有激酶結(jié)構(gòu)域或MAP4K4的非活性形式的MAP4K4過表達對ADAM10磷酸化顯示出邊際效應(yīng)。表明MAP4K4的激酶活性是ADAM10磷酸化所必需的。在所有突變體中，作者觀察到S436A突變體中ADAM10磷酸化的顯著減少。用磷酸標記凝膠檢測ADAM10磷酸化觀察到一致的結(jié)果。S436屬于金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域。因此，推測S436磷酸化是否在ADAM10活性的控制中。通過檢測N-鈣粘蛋白的穩(wěn)定性來研究S436磷酸化對ADAM10活性的影響。為此，構(gòu)建了催化失活的ADAM10 E384A突變體作為陰性對照，并構(gòu)建了ADAM10 S436E突變體以模擬S436的磷酸化。在S436E突變體和E384A突變體中觀察到N-鈣粘蛋白降解的顯著減弱，這表明ADAM10的S436磷酸化可能控制其活性。為了確定MAP4K4是否直接磷酸化ADAM10，進行體外激酶測定，其中將純化的ADAM10 WT、ADAM10 S436A突變體與MAP4K4孵育。結(jié)果表明，ADAM10 WT可以磷酸化，而ADAM10 S436A不能磷酸化。為了測試ADAM10 S436A是否影響其與MAP4K4結(jié)合的能力以及隨后磷酸化的降低，進行了免疫沉淀。通過WB檢測ADAM10與標記有Flag的MAP4K4。未觀察到ADAM10帶的顯著減少。此外，質(zhì)譜分析證實S436是ADAM10的磷酸化位點。這些數(shù)據(jù)表明MAP4K4在S436磷酸化ADAM10，從而抑制ADAM10的活性。

7、MAP4K4促進裸鼠異種移植模型中卵巢癌轉(zhuǎn)移

為了驗證MAP4K4在體內(nèi)卵巢癌癥轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)功能，建立了體內(nèi)異種移植裸鼠模型。首先，使用MAP4K4抑制劑GNE-495來抑制MAP4K4的活性：在將SKOV3細胞注射到裸鼠腹腔兩周后，每天通過腹膜內(nèi)注射注射GNE-495，28天后，處死小鼠，收獲腫瘤組織，測定轉(zhuǎn)移數(shù)量。結(jié)果顯示：未經(jīng)GNE-495處理的小鼠的卵巢細胞腹膜內(nèi)播散比接受GNE-496治療的老鼠明顯得多，尤其是在腸系膜、脾臟和肝臟。HE染色顯示腫瘤細胞侵入肝組織。此外，對腫瘤淋巴結(jié)數(shù)量的定量分析表明，對照組形成了更多的轉(zhuǎn)移。N-鈣粘蛋白的免疫熒光分析和免疫組織化學(xué)染色表明，當用GNE-495處理時，N-鈣粘素減少。為了排除GNE-495的非特異性作用，將MAP4K4-KO SKOV3細胞和對照細胞腹膜內(nèi)注射到裸鼠中。與對照組相比，MAP4K4敲除顯著減少了腹膜轉(zhuǎn)移的數(shù)量。這些結(jié)果表明MAP4K4促進了卵巢癌癥轉(zhuǎn)移的形成。

總結(jié)

轉(zhuǎn)錄組分析已將MAP4K4確定為卵巢癌轉(zhuǎn)移的新型啟動子。MAP4K4能夠增強細胞粘附，遷移和侵襲，穩(wěn)定N-鈣粘蛋白并促進體內(nèi)轉(zhuǎn)移。MAP4K4通過在Ser436磷酸化ADAM10來控制N-鈣粘蛋白的穩(wěn)定，導(dǎo)致ADAM10活性降低。綜上所述，MAP4K4是一種新穎而重要的抗轉(zhuǎn)移治療靶點。