調(diào)控蛋白通過分子間的相互作用來發(fā)揮生物學(xué)功能，進(jìn)而影響到生物表型，這是生物功能研究最簡單的邏輯結(jié)構(gòu)。發(fā)生功能的生物大分子，其相互作用可不像不諳世事的鋼鐵直男，只有“是”與“否”兩個(gè)簡單的選擇。處于調(diào)控通路的關(guān)鍵蛋白，往往萬轉(zhuǎn)千回，各種效應(yīng)因子參與其中，與高級結(jié)構(gòu)修飾（泛素化、磷酸化、乙?；龋┚o密聯(lián)系在一起，讓調(diào)控過程撲朔迷離。

通過大量參考文獻(xiàn)可以看出，絕大部分的調(diào)控蛋白都有不同程度的泛素化和去泛素化現(xiàn)象，因此，解析蛋白的泛素化過程，更能還原分子功能的真實(shí)機(jī)制。

泛素底物蛋白與對應(yīng)的E3連接酶種類繁多，目前的AI僅能預(yù)測人、小鼠以及少量的模式植物，對于植物科研的研究者來說，只能孤身勇往直前。鐘鼎生物在為科研用戶進(jìn)行基因功能驗(yàn)證時(shí)，與諸多科學(xué)家一道，總結(jié)出一套簡便可行，成功率高的實(shí)驗(yàn)策略。

第一步：發(fā)現(xiàn)潛在的E3連接酶

A計(jì)劃：針對關(guān)鍵的調(diào)控基因，可以通過酵母雙雜交篩選技術(shù)或者pull down-LC-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)其特異性的E3連接酶。

B計(jì)劃：通過UbiBrowser針對底物靶蛋白預(yù)測其最可能的E3連接酶。

第二步：驗(yàn)證底物蛋白與E3連接酶的互作關(guān)系

按照鐘鼎生物數(shù)十例的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)來看，最終泛素化成功的案例中，底物蛋白與E3連接酶在體外無一例外都有相互作用，因此進(jìn)行蛋白泛素化之前，建議先確證底物蛋白與E3連接酶的互作關(guān)系。

A計(jì)劃：表達(dá)E3蛋白及底物蛋白，使用GST pull down方法驗(yàn)證底物蛋白與E3連接酶互作，如果重組表達(dá)蛋白呈現(xiàn)包涵體狀態(tài)，可以嘗試使用無細(xì)胞表達(dá)體系，獲得可行性蛋白。

B計(jì)劃：使用酵母雙雜交點(diǎn)對點(diǎn)驗(yàn)證底物蛋白與E3連接酶互作

第三步：蛋白泛素化及泛素化水平檢測

蛋白泛素化是在E1\E2\E3\Substrate\Ub\ATP酶促體系內(nèi)完成，鐘鼎生物目前有兩種方案可以實(shí)現(xiàn)蛋白泛素化，分別是細(xì)胞裂解液法（體內(nèi)法）和商業(yè)試劑盒法（體外法）。

A體內(nèi)法：鐘鼎生物構(gòu)建了E1/E2/Ub三蛋白共表達(dá)的酵母菌株，只需要E3連接酶蛋白和底物蛋白添加到泛素酵母細(xì)胞裂解液中，即可實(shí)現(xiàn)半體內(nèi)的泛素化反應(yīng)，也有一些科學(xué)家將底物及E3連接酶在研究的宿主材料中過表達(dá)，可以完全實(shí)現(xiàn)體內(nèi)泛素化，這個(gè)方案鐘鼎生物暫未建立，無法提供該類型技術(shù)服務(wù)。

B體外法：使用商業(yè)化的泛素試劑盒，按照操作流程進(jìn)行泛素化操作,反應(yīng)結(jié)束后，可以使用泛素抗體檢測底物的泛素化水平， 亦可以使用底物蛋白的特異性抗體或攜帶的標(biāo)簽抗體進(jìn)行檢測， 如果需要使用兩種抗體同步檢測，加收相應(yīng)的檢測費(fèi)用。

參考文獻(xiàn):
Proteasomal degradation of MaMYB60 mediated by the E3 ligase MaBAH1 causes high temperature-induced repression of chlorophyll catabolism and green ripening in banana

說明：MYB60是調(diào)控下游葉綠素基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，推測RING類E3泛素連接酶MaBAH1介導(dǎo)MaMYB60泛素化降解，從而減弱MaMYB60對下游葉綠素降解代謝途徑的激活效應(yīng)，通過GST pull down實(shí)驗(yàn)?zāi)茏C明兩者的相互作用，通過泛素化實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)一步驗(yàn)證這一推論。

參考文獻(xiàn)：
The Arabidopsis U‐box E3 ubiquitin ligase PUB30 negatively regulates salt tolerance by facilitating BRI1 kinase inhibitor 1 (BKI1) degradation