01研究背景

宮頸癌Cervical cancer (CC)是全球第3種女性最常見的癌癥， 免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療已被推薦作為PD-L1陽性腫瘤的二線治療，多組學(xué)和單細(xì)胞RNA測序技術(shù)的最新進(jìn)展對腫瘤微環(huán)境?(TME)的特征做出了重大貢獻(xiàn)。然而，免疫病理特征不明確導(dǎo)致特異性免疫治療策略選擇依舊困難。對不同階段CC的TME的所有細(xì)胞類型進(jìn)行分析以了解其細(xì)胞生物學(xué)的努力仍然有限。

02前言

2023年01月，澳大利亞陽光海岸大學(xué)生物創(chuàng)新中心單位王天方課題組在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research期刊發(fā)表的題為 “Single-nucleus RNA sequencing and deep tissue proteomics reveal distinct tumour microenvironment in stage-I and II cervical cancer”（IF：11.3）的研究成果，通過單核RNA測序聯(lián)合蛋白質(zhì)組學(xué)等研究方法，揭示宮頸癌不同階段腫瘤微環(huán)境特征。

03研究方法

研究材料

（1）?宮頸癌腫瘤：I期(n=4)

（2）?宮頸癌腫瘤：II期(n=3)

研究技術(shù)

（1） 單核轉(zhuǎn)錄組學(xué)

（2） 蛋白質(zhì)組學(xué)

04研究思路

05

研究結(jié)果

1.??I、II期宮頸癌腫瘤細(xì)胞成分的鑒定

作者分別使用從I期(n=4)和II期(n=3)捐贈(zèng)者的腫瘤組織中分離的所有核進(jìn)行了單細(xì)胞測序（SnRNA-SEQ）實(shí)驗(yàn)，經(jīng)質(zhì)量控制，非監(jiān)督聚類分析后，確定了細(xì)胞類型樣本均質(zhì)性，比較了兩個(gè)階段不同細(xì)胞類型的比例。分析了差異表達(dá)基因(DEG)以確定細(xì)胞類型（圖1）。

2.?CCII患者TME中巨噬細(xì)胞以免疫抑制和促腫瘤生長表型為主?

差異基因表達(dá)分析顯示，CCII組中許多趨化因子、細(xì)胞因子和白細(xì)胞介素性細(xì)胞因子表達(dá)顯著增加。GSEA分析上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是最豐富的途徑，與細(xì)胞骨架發(fā)育密切相關(guān)的P53信號(hào)通路、腫瘤壞死因子α信號(hào)傳導(dǎo)通路和細(xì)胞凋亡通路在CCII組中均有表達(dá)。CCI組干擾素誘導(dǎo)蛋白編碼基因的上調(diào)強(qiáng)烈支持干擾素-α和干擾素-β反應(yīng)通路的激活 (圖2)。

3.?CCI組和CCII組巨噬細(xì)胞異質(zhì)性分析?

進(jìn)一步分析巨噬細(xì)胞亞型以揭示細(xì)胞異質(zhì)性在兩個(gè)階段之間的變化。有五個(gè)亞型被鑒定。比較了與巨噬細(xì)胞功能相關(guān)的選定基因在各亞型中的平均表達(dá)。最后投影到Monocle3定義的二維狀態(tài)空間進(jìn)行偽時(shí)間分析，以推斷巨噬細(xì)胞發(fā)育的譜系軌跡。這在很大程度上反映了細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)在CCI組State-9細(xì)胞中的激活；相反，ECM-受體相互作用和PI3K-Akt信號(hào)在CCII State-9細(xì)胞中更為明顯(圖3)。

4.?CCII患者TME中T細(xì)胞功能受到抑制?

T細(xì)胞分為CD8?+ T、γδT細(xì)胞和T reg T細(xì)胞。CCI組CD8?+ 細(xì)胞數(shù)高于CCII組(圖4B)。兩組之間的三個(gè)T細(xì)胞群的分布在2D-tSNE空間中顯示(圖4C)。CD8?+ T細(xì)胞分為五個(gè)主要亞型，圖4D顯示了前100個(gè)DEG在兩組的三個(gè)T細(xì)胞群體中的等級(jí)聚集。CCI組CD8?+ 細(xì)胞中與干擾素反應(yīng)密切相關(guān)的幾個(gè)基因在CCIγδT細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，與抗原提呈有關(guān)的兩個(gè)基因(CD38和CD48)在CD8T和T細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而在γδT細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。CCII組CD8?+ T和T reg T細(xì)胞的數(shù)量顯著高于CCI組(圖4)。

5.?CCII患者TME中的B細(xì)胞和DC表現(xiàn)為MHC-I類抗原反應(yīng)受到抑制?

作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CCI組DC數(shù)量更多，而CC?II組的B細(xì)胞數(shù)量更豐富(圖5A)。?MHC-I類抗原處理相關(guān)的選定DEG在CCI組的B細(xì)胞中上調(diào)(圖5D)。CCII組的天然B細(xì)胞中存在COL3A1、COLA1和COLA2的升高(圖5e)。 CCI組B細(xì)胞中與I型和II型干擾素信號(hào)相關(guān)的兩組基因上調(diào)， CCII組天然B細(xì)胞的IL-18信號(hào)和趨化因子活性明顯增強(qiáng)。CCII組B細(xì)胞胸腺間質(zhì)淋巴生成素(TSLP)和B細(xì)胞受體信號(hào)過度表達(dá)?(圖5)。

6.?CCI組NK細(xì)胞活化程度較高?

NK細(xì)胞群分別占CCI和CCII細(xì)胞的2.52%和0.85%。KEGG表明CCI組的大多數(shù)NK細(xì)胞表達(dá)與激活的NK細(xì)胞功能正相關(guān)的標(biāo)記基因的水平較高 (圖6A)。CCII組NK細(xì)胞表達(dá)調(diào)控IL17和腫瘤壞死因子信號(hào)的基因，表達(dá)活化的NK細(xì)胞標(biāo)記基因的細(xì)胞在2D-tSNE空間中的分布表明(圖6B)。與趨化因子和細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的DEG在CCI組中的平均表達(dá)和表達(dá)百分比大多升高(圖6C)。GSEA提示“自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”是CCI組唯一豐富的KEGG途徑(圖6d)。因此，在免疫應(yīng)答方面，CCI NK細(xì)胞比CCII組更活躍(圖6)。

7.?CCI和CCII患者的癌細(xì)胞具有明顯的異質(zhì)性?

干細(xì)胞和上皮細(xì)胞被認(rèn)為與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的幾種細(xì)胞類型。CCII組的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)數(shù)量較高。而CCII組脂肪基質(zhì)細(xì)胞(ADSCs)比例較低 (圖7A)。GSEA發(fā)現(xiàn)提示CCI組CSCs中富含的前6條途徑與免疫反應(yīng)有關(guān) (圖7C)。相反，與細(xì)胞生長相關(guān)的通路在CCII CSCs中高度激活。轉(zhuǎn)化生長因子β信號(hào)和細(xì)胞外基質(zhì)組織在CCII組的ADSCs中更為豐富，而CCI組的ADSCs中檢測到離子膜轉(zhuǎn)運(yùn)的激活(圖7D)。與多種癌癥相關(guān)的信號(hào)通路是在基底細(xì)胞和上皮細(xì)胞中都豐富的KEGG通路之一 (圖7E和7F)。值得注意的是，在CCII組的這些細(xì)胞中，膠原蛋白的表達(dá)總體上是上調(diào)的，角蛋白也是如此，除了淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，提示它們在臨床診斷中有潛在的應(yīng)用價(jià)值(圖7)。

8.?定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示CCII患者存在顯著的免疫抑制?

CCI和CCII組共鑒定出14,855種蛋白質(zhì) (圖8A)。CCII組顯著上調(diào)的DEPS表現(xiàn)出高度的相互作用，其中AKT1是最高的，與其他幾個(gè)與細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)育相關(guān)的高度節(jié)點(diǎn)相互作用 (圖8C)。MMP9與免疫相關(guān)節(jié)點(diǎn)之間存在相互作用。GSEA顯示，CCI組干擾素-α和干擾素-β反應(yīng)豐富，而CCII組通過NFαB的腫瘤壞死因子κ信號(hào)豐富(圖8D)。然后，我們比較了在干擾素-α反應(yīng)通路上檢測到的編碼DEP的基因在免疫細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞、T reg 、NK、B細(xì)胞和DC表達(dá)較多，其中巨噬細(xì)胞的表達(dá)水平最高(圖8e)。CCII組中與免疫過程相關(guān)的前20個(gè)顯著調(diào)控蛋白質(zhì)的FC值(基于GO項(xiàng))與它們的基因在不同免疫細(xì)胞群中的表達(dá)相關(guān)(圖8F)。因此，總體而言，相對于CCI患者，CCII組形成了更具免疫抑制作用的TME。

06研究結(jié)論

這項(xiàng)研究使用SnRNA-seq分析比較了I期和II期CC患者TME內(nèi)的細(xì)胞異質(zhì)性和功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCI表現(xiàn)出明顯的促炎功能，表現(xiàn)為明顯激活的干擾素-α和干擾素-γ反應(yīng)信號(hào)，而CCII的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出許多與細(xì)胞生長和組織發(fā)育相關(guān)的通路的激活。CD8?+ T細(xì)胞在CCI組較低，T reg 和γδT顯著減少。免疫反應(yīng)，尤其是MHC-I類途徑，在CCI組的DC和B細(xì)胞中更為明顯，而CCII組的代謝和發(fā)育過程更豐富。CCII組NK細(xì)胞比例較CCI組降低60%以上，多項(xiàng)指標(biāo)NK細(xì)胞功能上調(diào)。CCI組的免疫反應(yīng)相關(guān)途徑普遍豐富于幾種干細(xì)胞類型，而CCII組的細(xì)胞和組織生長以及代謝途徑高度豐富。此外，定量蛋白質(zhì)組學(xué)顯示CCI組干擾素-α和干擾素-γ反應(yīng)信號(hào)被激活，這與SNRNA-seq分析觀察到的結(jié)果一致。