前言

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是最常見的骨骼疾病，由于骨質(zhì)疏松早期沒有明顯癥狀，很容易被人們忽視，因此也被稱為“隱形殺手”。目前我國(guó)OP患者已超過7000萬，居全球之首。然而，目前OP的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，阻礙了有效治療方法的發(fā)展。2022年3月，蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科主任兼骨科研究所所長(zhǎng)楊惠林教授、骨科耿德春教授團(tuán)隊(duì)在Autophagy雜志（IF：16.016）在線發(fā)表了題為“TET2 regulates osteoclastogenesis by modulating autophagy in OVX-induced bone loss”的研究論文，蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院楊晨碩士，陶華強(qiáng)碩士，張海峰博士和夏宇博士為共同第一作者。研究揭示了在OVX小鼠模型中，TET2下調(diào)BCL2的表達(dá)并增強(qiáng)了BECN1依賴的自噬，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞活化和骨量流失，該研究為骨質(zhì)疏松的治療提供了新的靶點(diǎn)。文章中的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)由歐易生物提供。

研究背景

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是一種以骨量減少，骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病，多見于絕經(jīng)后女性和老年男性。絕經(jīng)后雌激素水平降低，破骨細(xì)胞數(shù)量增加、凋亡減少、壽命延長(zhǎng)，骨吸收功能增強(qiáng)，導(dǎo)致骨量快速流失。鑒于破骨細(xì)胞過度活化在骨破壞和骨質(zhì)疏松癥中的重要作用，深入研究破骨細(xì)胞活化的機(jī)制對(duì)于抑制絕經(jīng)后骨量的快速流失至關(guān)重要。

TET2（tet methylcytosine dioxygenase 2）是一種DNA去甲基化酶，也是轉(zhuǎn)錄輔助因子，在細(xì)胞分化過程中對(duì)調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄起重要作用。此外，TET2可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。然而，TET2是否影響絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)展過程中的破骨細(xì)胞自噬和分化仍不清楚。

研究結(jié)果

OVX誘導(dǎo)自噬并上調(diào)破骨細(xì)胞中TET2的表達(dá)

首先，使用雙側(cè)OVX（卵巢切除術(shù)）建立雌激素缺乏的骨丟失小鼠模型。為了確定OVX誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞活化是否與自噬有關(guān)，用TNFSF11（腫瘤壞死因子配體超家族成員11）刺激Sham-BMs（骨髓細(xì)胞）和OVX-BMs，并測(cè)量自噬活性。TEM結(jié)果顯示，OVX-BMs中產(chǎn)生的自噬體和自溶酶體多于Sham-BMs（圖1A）。

內(nèi)源性LC3B的免疫熒光染色顯示相同的結(jié)果，并且在OVX-BMs中，自噬體標(biāo)志物L(fēng)C3B點(diǎn)的數(shù)量增加（圖1B，C）。自噬過程中內(nèi)源性LC3B-I向LC3B-II的轉(zhuǎn)化會(huì)增加，因此，通過Western blot進(jìn)一步檢測(cè)了LC3B-II:LC3B-I的比率。結(jié)果表明，LC3B-II:LC3B-I比率在破骨細(xì)胞分化過程中增加，并且在OVX-BMs中比在Sham-BMs中更高（圖1D，E）。這些結(jié)果表明，增強(qiáng)的自噬促進(jìn)了OVX誘導(dǎo)的小鼠骨丟失中過度的破骨細(xì)胞分化。

為了研究TET2是否影響OVX誘導(dǎo)的骨丟失中的破骨細(xì)胞分化，通過Western blot和RT-qPCR測(cè)量Sham-BMs和OVX-BMs中的TET2表達(dá)。結(jié)果表明，TET2在OVX-BMs中的表達(dá)更高，并且在破骨細(xì)胞分化過程中進(jìn)一步增加（圖1F-H）。以上結(jié)果表明TET2對(duì)破骨細(xì)胞分化和OVX誘導(dǎo)的骨破壞至關(guān)重要。

圖1 | OVX 誘導(dǎo)自噬并上調(diào)破骨細(xì)胞中TET2的表達(dá)

TET2對(duì)破骨細(xì)胞生成過程中自噬的影響

為了研究TET2在破骨細(xì)胞分化過程中是否影響自噬，使用LV-sh慢病毒顆粒抑制TET2表達(dá)，并評(píng)估自噬活性。TEM結(jié)果顯示，LV-NC BMs在破骨細(xì)胞分化過程中自噬體和自溶酶體增加，LV-sh組的自噬體和自溶酶體少于LV-NC組（圖2A）。

免疫熒光染色顯示LV-sh處理的BMs中LC3B點(diǎn)的數(shù)量減少（圖2B，C）。在破骨細(xì)胞分化過程中，LV-NC BMs的LC3B-II:LC3B-I比率會(huì)增加，然而敲降降低了LC3B-II:LC3B-I的比率（圖2D，E）。

此外，研究了TET2抑制對(duì)破骨細(xì)胞生成的影響，ACP5染色結(jié)果顯示敲降后ACP5陽性細(xì)胞的形成明顯減少（圖2F，G）。骨吸收測(cè)定顯示LV-sh組的骨吸收面積減少（圖2H，I）。Western blot顯示在敲降Tet2后，破骨細(xì)胞標(biāo)志物MMP9和CTSK的水平降低（圖2J，K）。破骨細(xì)胞因子和的mRNA水平在敲降后降低了（圖2L）。以上結(jié)果表明，TET2抑制可以減少自噬并損害TNFSF11誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成和活化。

圖2 | TET2對(duì)破骨細(xì)胞生成過程中自噬的影響

敲降改變了破骨細(xì)胞的基因表達(dá)譜并通過增加BCL2表達(dá)來減少自噬囊泡的形成

為了探索TET2調(diào)節(jié)自噬和破骨細(xì)胞分化的潛在分子機(jī)制，用TNFSF11處理細(xì)胞1或3天后，在敲降的BMs中進(jìn)行RNA-seq。與對(duì)照BMs相比，在敲降的BMs中共鑒定到1753個(gè)（1天）和1372個(gè)（3天）基因表達(dá)存在顯著差異（P < 0.05）（FC > 1.5，且FDR < 0.05）（圖3A、B）。破骨細(xì)胞中和等關(guān)鍵基因的表達(dá)在LV-sh 破骨細(xì)胞中顯著降低，并且RNA-seq的結(jié)果通過RT-qPCR得到了驗(yàn)證。因此，敲降顯著抑制了功能性破骨細(xì)胞基因的表達(dá)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LV-sh干預(yù)后，和等功能性自噬基因的mRNA水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化。Western blot和RT-qPCR結(jié)果證實(shí)，BCL2（自噬的負(fù)調(diào)節(jié)因子）的水平在分化過程中的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)（1天和3天）均顯著增加（圖3C、D)。因此，假設(shè)TET2通過BCL2影響破骨細(xì)胞自噬并進(jìn)一步影響破骨細(xì)胞功能。

圖3 | 敲降改變了破骨細(xì)胞的基因表達(dá)譜并通過增加BCL2表達(dá)來減少自噬囊泡的形成

干擾BCL2可增強(qiáng)TET2抑制后的自噬和破骨細(xì)胞分化

為了研究BCL2對(duì)破骨細(xì)胞自噬和分化的影響，使用siRNA來降低LV-sh慢病毒顆粒刺激的破骨細(xì)胞中BCL2的表達(dá)。敲降后，自噬的減少被部分逆轉(zhuǎn)，自噬體、自溶酶體和LC3B點(diǎn)的數(shù)量增加（圖4A-C）。Western blot證實(shí)了LC3B-II：LC3B-I的比率在siRNA處理組中增加（圖4D和E）。這些結(jié)果表明降低BCL2表達(dá)減輕了TET2抑制誘導(dǎo)的自噬失調(diào)。

BCL2與BECN1結(jié)合并阻止BECN1促進(jìn)其他自噬蛋白定位到吞噬細(xì)胞組裝位點(diǎn)，從而阻止自噬。Co-IP結(jié)果表明，抗BCL2抗體可以在LV-NC和LV-sh RAW264.7細(xì)胞中與BECN1結(jié)合；此外，更多的BECN1在LV-shRAW264.7細(xì)胞中被拉下（圖4F，G）?？笲ECN1抗體與BCL2相互結(jié)合，在敲降后相互作用增加（圖4H，I）。這些結(jié)果表明TET2通過負(fù)調(diào)節(jié)BCL2表達(dá)來促進(jìn)BECN1介導(dǎo)的破骨細(xì)胞自噬。

圖4 | 敲降增強(qiáng)了LV-sh轉(zhuǎn)染的BMs中的自噬

此外，探究了BCL2對(duì)破骨細(xì)胞生成的影響。ACP5染色顯示，在LV-sh BMs中敲降后，ACP5陽性多核細(xì)胞的形成增加（圖5A，B）。骨吸收測(cè)定表明，敲降后骨吸收面積增加（圖5C，D）。Western blot結(jié)果顯示，破骨細(xì)胞中功能蛋白（MMP9和CTSK）的表達(dá)被部分逆轉(zhuǎn)（圖5E，F(xiàn)）。在敲降后，和的mRNA水平增加（圖5G-J）。綜上結(jié)果表明，敲降是通過增加BCL2表達(dá)和減少BECN1依賴性自噬來減少破骨細(xì)胞分化。

圖5 | 敲降增強(qiáng)了LV-shTet2轉(zhuǎn)染的BMs中破骨細(xì)胞的分化

敲降TET2可改善OVX小鼠的骨質(zhì)流失

為了闡明TET2在OVX誘導(dǎo)的骨流失中的作用，用LV-sh慢病毒來抑制OVX小鼠BMs中TET2的表達(dá)。3D Micro-CT重構(gòu)圖像表明，OVX小鼠的股骨骨量顯著減少。在用LV-sh慢病毒而非LV-NC慢病毒治療后，骨量的變化部分恢復(fù)（圖6A）。

此外，骨參數(shù)的定量分析表明，與Sham小鼠相比，OVX模型小鼠的骨礦物質(zhì)密度（BMD）、每組織體積的骨體積（BV/TV）、骨小梁數(shù)（Tb.N）和骨體積（BV）減少，骨小梁分離（Tb.sp）增加。在用LV-sh治療后，逆轉(zhuǎn)了上述變化（圖6D-H）。

H&E染色用于小鼠股骨組織切片的組織學(xué)染色，以進(jìn)一步評(píng)估骨組織微觀結(jié)構(gòu)。與LV-NC處理的OVX小鼠相比，LV-sh處理的OVX小鼠骨質(zhì)疏松表型顯著改善（圖6B，I）。ACP5染色顯示LV-sh顯著降低了OVX組的破骨細(xì)胞數(shù)量（圖6C，J）?？傊贠VX模型中驗(yàn)證了干擾TET2表達(dá)可顯著改善小鼠骨量流失。

圖6 | 敲降可防止體內(nèi)OVX誘導(dǎo)的骨流失

研究結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)TET2通過抑制BCL2表達(dá)和正調(diào)節(jié)BECN1依賴性自噬來促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，靶向阻斷TET2可降低自噬活性并減輕OVX誘導(dǎo)的骨流失。本研究結(jié)果加強(qiáng)了TET2對(duì)自噬和破骨細(xì)胞分化的表觀遺傳調(diào)控的理解，為闡明破骨細(xì)胞的生成機(jī)制提供了新基礎(chǔ)。

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