文章標題：A functional role of meningeal lymphatics in sex difference of stress susceptibility in mice

發(fā)表期刊：Nature Communications

影響因子：17.694

發(fā)表時間：2022年8月

作者單位：中山大學中山醫(yī)學院

百趣提供服務(wù)：發(fā)現(xiàn)代謝組學Standard-親脂版

百趣代謝組學分享—研究背景

代謝組學文獻分享，抑郁癥(Major Depressive Disorder, MDD)作為一種常見的精神疾病，其特征是持續(xù)的抑郁情緒以及動力和興趣的喪失。現(xiàn)如今，影響全球約4.4%的人口，是非致命健康損失的主要原因。

目前研究表明，女性比男性更容易患上抑郁癥，并伴隨著更嚴重的抑郁癥狀。代謝組學文獻分享，盡管在臨床報告中已有充分的證據(jù)證明抑郁癥存在著顯著的性別差異，但其潛在的機制很大程度上仍不清楚。

重復應(yīng)激是促進抑郁癥發(fā)病的重要環(huán)境因素。有學者發(fā)現(xiàn)，反復的壓力同時也會引起免疫系統(tǒng)的顯著變化。代謝組學文獻分享，盡管這些發(fā)現(xiàn)表明異常免疫功能與抑郁癥之間有很強的聯(lián)系，但對于壓力如何改變免疫系統(tǒng)來調(diào)節(jié)抑郁癥的易感性，我們?nèi)匀恢跎?。代謝組學文獻分享，長期以來，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System, CNS)一直被認為是一種“免疫特權(quán)”器官，因為它缺乏淋巴管來運輸免疫細胞。然而，最近的研究證實了人類和其他動物的硬腦膜中存在淋巴管。

這些腦膜淋巴管通過連接頸深淋巴結(jié)(deep Cervical Lymph Nodes, dCLNs)不斷將CNS的液體和分子引流到外周，并在免疫細胞的主動運輸中發(fā)揮重要作用。據(jù)報道，發(fā)生在衰老過程中腦膜淋巴管的改變，能夠促使神經(jīng)退行性和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的進展，代謝組學文獻分享，包括阿爾茨海默氏病、帕金森病、創(chuàng)傷性腦損傷、腦炎和腦瘤。然而，應(yīng)激是否影響腦膜淋巴調(diào)節(jié)抑郁癥的發(fā)展仍有待進一步研究。

百趣代謝組學分享—研究方法

在這項研究中，我們使用亞慢性變應(yīng)激(Sub-Chronic Variable Stress，SCVS)刺激小鼠，在6d內(nèi)將小鼠暴露于三種交替的應(yīng)激源中。代謝組學文獻分享，據(jù)報道，這種模式會誘導女性產(chǎn)生抑郁癥狀，但在男性中沒有。因此模式為本研究內(nèi)容提供了一個合適的模型。

實驗前每天處理動物2~3min，連續(xù)處理3d。然后，它們在6d內(nèi)交替受到三種不同的壓力源，以避免習慣化：第1d，小鼠接受100個（0.45mA，1s）的隨機間隔腳電擊，持續(xù)1h。第2d，小鼠接受尾懸掛壓力，持續(xù)1h。第3d，將每只小鼠置于家中籠子的穿孔約束管中，持續(xù)1h。代謝組學文獻分享，在接下來的3d里重復同樣的壓力源（圖1）。

圖1. SCVS處理和行為測試的實驗時間表

百趣代謝組學分享—研究結(jié)果

1.亞慢性變應(yīng)激對雌性小鼠腦膜淋巴細胞有損害作用，但對雄性小鼠無影響

在SCVS處理后，雌雄小鼠均有顯著的體重減輕（圖2b，3b）。代謝組學文獻分享，另外，應(yīng)激雌性小鼠較少前往開闊場地的中心區(qū)域（圖2f-i），表現(xiàn)出抑郁和焦慮樣行為。

圖2. 6d的SCVS誘導雌性小鼠的抑郁和焦慮樣行為

相比之下，應(yīng)激雄性小鼠在開闊視野中心區(qū)域的行走距離顯著增加，顯示出抗焦慮表型（圖3f-i）。

圖3. 6d的SCVS誘導雄性小鼠的抑郁和焦慮樣行為

qPCR分析顯示，SCVS處理顯著降低雌性小鼠硬腦膜淋巴管內(nèi)皮受體-1(Lymphatic vessel endothelial Receptor-1, Lyve1)的mRNA水平，而SCVS處理下的雄性小鼠無顯著降低（圖4a-c）。

圖4. SCVS引起的硬腦膜Lyve1 mRNA表達變化的性別差異，以及幼稚雌性和雄性小鼠腦膜淋巴管的比較

為了進一步驗證SCVS處理對雌性小鼠腦膜淋巴的損傷，在最后一次行為測試72h后向小腦延髓池注入70kD葡聚糖示蹤劑，1h后恢復正常（圖5a-c）。

圖5. SCVS損害雌性小鼠而非雄性小鼠的腦膜淋巴管

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌性小鼠出現(xiàn)腦膜淋巴管形態(tài)的損傷（圖6）。相比之下，雄性小鼠在SCVS處理后，腦膜淋巴系統(tǒng)雖然對應(yīng)激表現(xiàn)出一定的敏感性，但與非應(yīng)激成年雌性和雄性小鼠相比，腦膜淋巴管的整體形態(tài)以及腦內(nèi)注射示蹤劑到dCLNs的引流沒有顯著差異（圖4d-h）。

圖6. SCVS處理過的24h后雌性小鼠的腦膜淋巴管受損情況

2.改善腦膜淋巴管可減輕雌性小鼠對應(yīng)激的敏感性

為了研究改善腦膜淋巴系統(tǒng)能否使雌性小鼠抗應(yīng)激能力增強。將血管內(nèi)皮生長因子c(Vascular Endothelial Growth Factor-C, VEGFC)過表達的腺相關(guān)病毒(Adeno-Associated Virus, AAV)或增強型綠色熒光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP)注射到雌性小鼠的小腦延髓池中作為對照。代謝組學文獻分享，一個月后，兩組小鼠均接受6d的SCVS處理（圖7a）。結(jié)果顯示VEGFC處理的雌性小鼠在SCVS處理后體重下降程度顯著減少（圖7k）。在濺水測試中，它們的梳理時間顯著增加，在強迫游泳測試中減少了靜止的時間，并增加了在開放場地測試中對中心區(qū)域的探索（圖7l-p）。

圖7. 腦內(nèi)注射AAV-VEGFC改善了雌性小鼠的腦膜淋巴管，減輕了應(yīng)激誘導的抑郁樣行為

在非應(yīng)激雌性小鼠中，腦內(nèi)注射AAV-VEGFC促進了腦膜淋巴生長，但不影響上述行為（圖8a-m）。代謝組學文獻分享，這表明腦膜淋巴管的增強本身并不足以改變雌性小鼠的抑郁或焦慮類行為，相反，增強了它們對壓力的適應(yīng)能力。

圖8. AAV-VEGFC的池內(nèi)遞送改善了腦膜淋巴管，而不影響抑郁行為以及非應(yīng)激雌性小鼠mPFC中星形膠質(zhì)細胞蛋白的表達和VTA多巴胺能神經(jīng)元中c-FOS的表達

另外，與非應(yīng)激組相比，經(jīng)歷SCVS處理的雌性小鼠對社交活動和蔗糖水的偏好顯著降低，而這兩種偏好都被子宮內(nèi)注射AAV-VEGFC所消除（圖9a-e）。

圖9. 操縱腦膜淋巴管調(diào)節(jié)SCVS誘導的社交障礙和蔗糖偏好

3.腦膜淋巴管的改善可使應(yīng)激引起的雌性小鼠的mPFC和VTA發(fā)生改變

為了觀察SCVS和VEGFC處理是否會影響腦脊液在腦實質(zhì)的流入和擴散，將卵白蛋白(OVA)-Alexa Fluor 647示蹤劑注入雌鼠小腦延髓池，并于1h后灌流。代謝組學文獻分享，SCVS處理減少了在腦實質(zhì)、腦膜淋巴管附近和dcln中檢測到的示蹤劑（圖2j，p，q和圖10a-c），這表明SCVS處理增加了雌性小鼠腦室和蛛網(wǎng)膜下腔的示蹤劑積累。

由于SCVS處理后間質(zhì)流體(Interstitial Fluid, ISF)大分子的流動減少（圖10l-q），我們推斷SCVS處理損傷腦膜淋巴管可能導致脂質(zhì)在腦實質(zhì)積聚，進而導致內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(medial Prefrontal Cortex, mPFC)和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(Ventral Tegmental Area, VTA)異常，而VEGFC治療阻止了這些變化。

圖10. SCVS后雌性小鼠腦內(nèi)注射示蹤劑的分布

為此，對mPFC、VTA和硬腦膜進行脂質(zhì)組學分析，比較三組雌性小鼠：(1)未注射AAV-eGFP的小鼠；(2)注射AAV-eGFP并經(jīng)歷SCVS處理的小鼠；(3)小鼠注射AAV-VEGFC和經(jīng)歷SCVS處理（圖11a）。代謝組學文獻分享，通過OPLS-DA評分圖發(fā)現(xiàn)三組分離明顯（圖11b）。SCVS處理后，包括長鏈甘油三酯(triacylglycerols, TAG)在內(nèi)的多種脂質(zhì)在mPFC中顯著增加，而在SCVS處理后VTA中也有一小部分TAG的增加，這被VEGFC治療部分阻止了（圖11c，d）。代謝組學文獻分享，重要的是，VEGFC治療顯著增加了硬腦膜中包括長鏈TAG在內(nèi)的一組脂質(zhì)分子（圖11e）。

圖11. 幼稚雄性小鼠腦內(nèi)注射AAV-VEGFR3d1-4或經(jīng)歷SCVS的雄性小鼠AAV-VEGFC不會改變抑郁和焦慮樣行為

4.腦膜淋巴管損傷使雄性小鼠易受應(yīng)激影響

VEGFR3d1-4-IgG Fc的過表達顯著降低硬腦膜上矢狀竇(Superior Sagittal Sinus, SSS)和橫竇(Transverse Sinus, TS)/竇匯(Confluence Of Sinuses, COS)中的Lyve1的表達，以及Lyve1標記的腦膜淋巴管的直徑和覆蓋面積（圖12c-g）。同時，在硬腦膜和dcln中檢測到的腔內(nèi)注射示蹤劑的數(shù)量顯著減少（圖12c，h-j）。

重要的是，VEGFR3d1-4-IgG Fc過表達的雄性小鼠在濺水試驗中梳洗時間顯著減少，在強迫游泳試驗中靜止時間顯著增加，并在SCVS處理后表現(xiàn)出社交障礙（圖12k，l和圖9f-I）。代謝組學文獻分享，VEGFR3d1-4或vegfr3d4-7過表達的雄性小鼠在抑制攝食試驗中，在進食潛伏期、體重變化、整體運動和開放場地試驗中對中心區(qū)域的探索方面均無顯著差異，在蔗糖偏好試驗中也無顯著差異（圖12r和圖9f，j）。

值得注意的是，在沒有SCVS處理的情況下，VEGFR3d1-4單獨治療并不會影響非應(yīng)激雄性小鼠在抑郁行為測試中的表現(xiàn)（圖11a-d），這表明腦膜淋巴損傷本身不足以誘導雄性小鼠的抑郁行為，但會增加它們對應(yīng)激的敏感性。代謝組學文獻分享，此外，SCVS處理的雄性小鼠中，腦內(nèi)注射過表達VEGFC的AAV并不會影響動物在抑郁和焦慮類行為測試中的表現(xiàn)，也不會影響體重的變化（圖11i-q），這表明腦膜淋巴在調(diào)節(jié)抑郁和焦慮類行為中的作用存在“天花板效應(yīng)”。

圖12. 腦內(nèi)注射AAV-VEGFR3d1-4可損害雄性小鼠腦膜淋巴管痙攣并促進應(yīng)激誘導的抑郁行為

另外，SCVS處理并未顯著改變雄性小鼠mPFC中星形細胞蛋白的表達，也未改變VTA中TH+多巴胺能神經(jīng)元中c-FOS的表達。代謝組學文獻分享，然而，VEGFR3d1-4處理后的雄性小鼠在mPFC中S100β+和GFAP表達明顯減少，S100β+星形膠質(zhì)細胞密度降低，在VTA中TH+多巴胺能神經(jīng)元中c-FOS表達減少（圖13-j）。

綜上所述，腦膜淋巴管的損傷或通過腦膜淋巴管的引流增加了雄性小鼠對應(yīng)激的敏感性，并促進了應(yīng)激引起的mPFC和VTA的異常。

圖13. 雄性小鼠腦內(nèi)注射AAV-VEGFR3d1-4可促進SCVS誘導的mPFC星形膠質(zhì)細胞標志物表達受損和VTA多巴胺神經(jīng)元c-FOS表達受損

5.亞慢性可變應(yīng)激改變雌性小鼠腦膜淋巴內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)錄譜

與非應(yīng)激小鼠相比，應(yīng)激雌性小鼠的硬腦膜中晶狀體上皮細胞(Lens Epithelial Cells, LECs)占存活細胞總數(shù)的百分比顯著降低。代謝組學文獻分享，進一步證明SCVS損害腦膜淋巴系統(tǒng)（圖14c）。其他腦膜細胞類型未檢測到明顯變化，包括血液內(nèi)皮細胞、白細胞和基質(zhì)細胞 （圖14d-f）。

Deseq2分析（一種轉(zhuǎn)錄組分析方法）以（p<0.1）為臨界值，篩選出236個差異表達基因(DEGs)，其中156個上調(diào)，80個下調(diào)（圖14g，h）。值得注意的是，表皮生長因子受體的表達是受應(yīng)激影響下調(diào)最多的基因之一，表明支持淋巴萌發(fā)的信號缺失（圖14h）。

我們進一步進行了基因集富集分析，結(jié)果顯示，在應(yīng)激雌性小鼠的腦膜LECs中，參與DNA復制、鞘脂生物合成、血清素攝取調(diào)控的基因集富集，而未在參與蛋白酶體組裝、核糖體分解、血小板衍生生長因子結(jié)合的基因集富集，表明應(yīng)激誘導的腦膜淋巴管功能發(fā)生了深刻變化（圖14i）。代謝組學文獻分享，另外，還發(fā)現(xiàn)幾個編碼膠原蛋白的基因，包括Col6a1，Col1a2，ndCol3a1以及編碼處理膠原蛋白的基質(zhì)金屬蛋白酶Mmp23的基因，在應(yīng)激和衰老中顯著下調(diào)，這表明與細胞外基質(zhì)的分離可能是介導腦膜淋巴變性的關(guān)鍵因素（圖14k）。

數(shù)據(jù)顯示CCL6基因的上調(diào)是雌性小鼠受到SCVS處理誘導的腦膜淋巴管覆蓋減少的潛在機制。從RNA-seq結(jié)果來看，C-C基序趨化因子受體（Ccr1，CCL6的受體）在未接種組雌性小鼠的腦膜LECs中表達較低。在SCVS處理組的5個生物重復中，有2個Ccr1mRNA水平升高，但在其他3個重復中保持較低水平?；谶@些數(shù)據(jù)，我們懷疑CCL6可能以細胞非自主的方式起作用，通過向硬腦膜細胞中介體發(fā)出信號，進而導致SCVS處理后雌性小鼠腦膜淋巴覆蓋的減少。

圖14. SCVS誘導雌性小鼠腦膜淋巴管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)錄變化

百趣代謝組學分享—結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)SCVS處理對雌性小鼠腦膜淋巴細胞有損害作用，而對雄性小鼠無損害作用。代謝組學文獻分享，功能獲得與喪失的研究進一步表明，腦膜淋巴管導致了小鼠對抑郁和焦慮行為應(yīng)激敏感性的性別差異。結(jié)果揭示了短期應(yīng)激對腦膜淋巴管形態(tài)和通過腦膜淋巴管的腦引流功能具有性別依賴性。另外，腦膜淋巴管的變化可以調(diào)節(jié)應(yīng)激敏感性。