淋巴結(jié)(LN)轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響腫瘤治療預(yù)后。研究表明，粒徑小于50 nm的納米粒靜脈給藥后可滲透進(jìn)入LN轉(zhuǎn)移灶中。同時，與非靶向納米載體相比，靶向腫瘤細(xì)胞的納米載體可在實體瘤的原發(fā)灶中集聚更多，從而提高治療效果。因此，我們推測通過賦予小于50 nm的納米載體對腫瘤細(xì)胞的靶向性，有望增強(qiáng)納米載體在LN轉(zhuǎn)移灶中的積累，并為LN轉(zhuǎn)移灶的局部治療(如光熱治療)提供更大的益處。

Targeted Micellar Phthalocyanine for Lymph Node Metastasis Homing and Photothermal Therapy in an Orthotopic Colorectal Tumor Model

Hai-Yi Feng, Yihang Yuan, Yunpeng Zhang, Hai-Jun Liu, Xiao Dong, Si-Cong Yang, Xue-Liang Liu, Xing Lai, Mao-Hua Zhu, Jue Wang, Qin Lu, Quanjun Lin, Hong-Zhuan Chen, Jonathan F. Lovell, Peng Sun*, Chao Fang*

Nano-Micro Letters?(2021)13: 145

https://doi.org/10.1007/s40820-021-00666-8

本文亮點

1.?采用表面活性劑剝脫法制備了小尺寸曲妥珠單抗靶向膠束(T-MP)，膠束內(nèi)核濃縮了酞菁染料，可產(chǎn)生很強(qiáng)的近紅外光熱效應(yīng)。

2.?與非靶向IgG偶聯(lián)的膠束相比，T-MP在原位結(jié)腸癌模型的淋巴結(jié)(LN)轉(zhuǎn)移灶中集聚更多。

3.?在手術(shù)切除原發(fā)腫瘤后，用T-MP微創(chuàng)光熱治療轉(zhuǎn)移性LN，顯著延長了小鼠的生存期。

內(nèi)容簡介

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院方超/孫鵬課題組采用獨(dú)特的表面活性劑剝脫方法，制備了曲妥珠單抗修飾的酞菁膠束(T-MP<50 nm)。T-MP具有很好的光熱轉(zhuǎn)換功能，可靶向性光熱消融過表達(dá)HER2的HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞。與非靶向膠束相比，T-MP在原位結(jié)腸腫瘤腸系膜LN轉(zhuǎn)移灶中集聚更多，且在手術(shù)切除原位腫瘤后，用T-MP微創(chuàng)光熱治療轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)，顯著延長了小鼠的生存期。其治療效果與傳統(tǒng)的淋巴結(jié)切除術(shù)相當(dāng)甚至更好，而后者通常會導(dǎo)致手術(shù)創(chuàng)傷和術(shù)后并發(fā)癥。研究結(jié)果首次證明，靶向性小尺寸納米粒子有望成為治療LN轉(zhuǎn)移的新范式。

圖文導(dǎo)讀

I?靶向膠束酞菁(T-MP)的制備和表征

Pluronic F127是一種FDA批準(zhǔn)的廣泛用于藥物遞送的非離子共聚物，本文采用表面活性劑剝脫方法制備酞菁膠束，且對F127的末端羥基通過與琥珀酸酐反應(yīng)而羧基化從而修飾具有靶向功能的曲妥珠單抗，得到T-MP。對其進(jìn)行理化特性的表征，考察光熱轉(zhuǎn)換和光聲成像性能。

圖1. VBPc膠束的表征。(A) MP(未修飾)和T-MP的TEM圖像。由動態(tài)光散射(DLS)確定的粒徑(B)和zeta電位(C)。(D) 游離抗體和T-MP的考馬斯藍(lán)染色(左)和近紅外熒光成像(右)。(E) 二氯甲烷中游離VBPc和水中MP的Vis-NIR吸收。(F) 在2 W/cm2下，T-MP的VBPc濃度依賴性升溫。其中插圖為5 min時的代表性光熱圖像。(G) T-MP (20 μg/ml VBPc) 的光功率依賴性升溫。其中插圖為5 min時的代表性光熱圖像。(H) 輻照時間對T-MP的Vis-NIR 吸收曲線的影響。(I) 在2 W/cm2的808 nm照射下激光誘導(dǎo)加熱T-MP (VBPc 20 μg/mL) 的連續(xù)循環(huán)。(J) T-MP的光聲(PA)成像特性。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。(n=3)。

II?T-MP在HT-29細(xì)胞中的增強(qiáng)攝取和光熱細(xì)胞毒性

HER2是多種癌癥的臨床相關(guān)治療靶點，包括乳腺癌、胃癌和肺癌。并且HER2與結(jié)直腸癌的進(jìn)展有關(guān)，針對結(jié)直腸癌的抗HER2治療正在進(jìn)行臨床試驗。本研究通過對13名結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中的HER2表達(dá)高于腫瘤基質(zhì)和鄰近正常組織中的表達(dá)。這些觀察結(jié)果表明 HER2受體可能是臨床相關(guān)的靶標(biāo)，適合用于結(jié)直腸癌靶向藥物遞送。HT-29-luc是一種具有強(qiáng)HER2表達(dá)的人類結(jié)直腸癌細(xì)胞系，利用該細(xì)胞系進(jìn)行膠束的攝取研究發(fā)現(xiàn)，與非靶向同種型IgG偶聯(lián)膠束(nonT-MP)相比，曲妥珠單抗修飾(T-MP)以時間依賴性方式將細(xì)胞攝取提高了2~4倍。這種效應(yīng)會導(dǎo)致對HT-29-luc的光熱細(xì)胞毒性顯著增強(qiáng)。

圖2. 靶向細(xì)胞攝取和提高光熱誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。(A) 與人類正常結(jié)腸組織相比，代表性免疫組織化學(xué)染色顯示人類患者結(jié)腸癌中的HER2高表達(dá)。(B) HT-29細(xì)胞中HER2表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析。#1、#2 和 #3為三個重復(fù)樣本。(C) HT-29-luc細(xì)胞在與iFluor 594標(biāo)記的膠束(Ex 563 nm，Em 604 nm)孵育1 h和4 h后細(xì)胞攝取的共聚焦熒光圖像。(D) 通過ArrayScan XTI高內(nèi)涵系統(tǒng)分析的HT-29細(xì)胞中的iFluor 594熒光強(qiáng)度。(E) 圖示顯示了靶向抗體修飾改善的細(xì)胞攝取如何增強(qiáng)光熱誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。(F) 用膠束和激光照射處理后的細(xì)胞活力。(G) Calcein AM/PI共染色HT-29-luc細(xì)胞經(jīng)過各種處理后的熒光顯微鏡圖像?；罴?xì)胞和死細(xì)胞分別以綠色(Calcein-AM; Ex 490 nm, Em 515 nm)和紅色(PI; Ex 530 nm, Em 580 nm)顯示。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。(n=3)。*p <0.05，**p <0.01，***p <0.001。

III?原位結(jié)直腸癌模型構(gòu)建和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中T-MP的靶向集聚

將腫瘤細(xì)胞注射到盲腸漿膜下層，建立原位HT-29-luc結(jié)腸癌模型。病理和免疫組織化學(xué)分析表明，可檢測到的淋巴轉(zhuǎn)移通常為單發(fā)病灶，且位于LN皮質(zhì)區(qū)域。原位和離體生物發(fā)光和熒光成像顯示，靜脈注射的Cy5.5標(biāo)記的T-MP可成功靶向轉(zhuǎn)移性腸系膜前哨LN。進(jìn)一步考察了轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中T-MP的時間依賴性分布。T-MP的積累隨著時間的推移而增加，并在注射后8 h達(dá)到峰值。T-MP在轉(zhuǎn)移性前哨LN中的靶向效果顯著優(yōu)于非靶向nonT-MP，分別在4 h和8 h表現(xiàn)出2.2倍和4.4倍的分布增加。

圖3. 原位HT-29-luc結(jié)腸癌模型構(gòu)建和T-MP對轉(zhuǎn)移性LN靶向。(A) 通過在盲腸中漿膜下注射腫瘤細(xì)胞(I)建立原位HT-29-luc腫瘤。2周后肉眼可見實體瘤(II)。(B) 蘇木精和伊紅(H&E)染色顯示原位腫瘤的正確解剖位置。(C) 腸系膜中轉(zhuǎn)移LN的圖示。(D) 靜脈注射的Cy5.5標(biāo)記的T-MP成功靶向轉(zhuǎn)移性腸系膜前哨LN。(I) 小鼠腹腔中原位HT-29-luc腫瘤的圖示。(II) 原位腫瘤和轉(zhuǎn)移LN的生物發(fā)光和熒光成像。(III) 腫瘤切除后轉(zhuǎn)移性LN的生物發(fā)光和熒光成像。(IV) 切除的轉(zhuǎn)移性LN的離體成像。(E) 轉(zhuǎn)移性LN中Cy5.5標(biāo)記膠束的時間依賴性離體成像。(F) 圖E中熒光強(qiáng)度統(tǒng)計。(G) 轉(zhuǎn)移性LN中的VBPc含量。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。圖F中n=3，圖G中n=5。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.01。

IV?轉(zhuǎn)移性LN中膠束的微觀分布以及光聲定位

本文為了進(jìn)一步研究膠束在轉(zhuǎn)移LN中的分布特征，對轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)進(jìn)行了免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)膠束主要分布在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移區(qū)，且T-MP在轉(zhuǎn)移區(qū)的積累比非靶向nonT-MP膠束高3.0倍。同時，兩個膠束在LN非轉(zhuǎn)移區(qū)的低分布量沒有顯著差異。此外光聲(PA)成像還顯示，與非T-MP相比，轉(zhuǎn)移性LN中T-MP的PA 信號更強(qiáng)(約6倍)。注意到PA信號在LN中分布不均勻，而是在一側(cè)分布更多，這種現(xiàn)象與轉(zhuǎn)移灶位于LN的外周皮層區(qū)域的觀察結(jié)果一致。

圖4. 轉(zhuǎn)移性LN中膠束的微分布及PA定位。(A) 靜脈注射T-MP或nonT-MP后8 h轉(zhuǎn)移性LN的免疫熒光染色。膠束用Cy5.5(紅色)標(biāo)記，轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞用兔抗HER2抗體和FITC二抗(綠色)染色。有轉(zhuǎn)移的區(qū)域(1和3)和無轉(zhuǎn)移區(qū)域(2和4)在圖B中被放大。(C) 定量圖B中的熒光強(qiáng)度。(D) 切除的轉(zhuǎn)移性 LN的體外PA成像以及信號強(qiáng)度統(tǒng)計。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。(n=3)。**p<0.01，***p<0.001。

V?轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的光熱治療和抗腫瘤功效

我們接下來研究了T-MP對轉(zhuǎn)移性LN的光熱療效。對HT-29-luc荷瘤小鼠靜脈注射T-MP或nonT-MP (5 mg/kg VBPc) 8 h后，手術(shù)切除原位腫瘤，用808 nm激光(2 W/cm2, 10 min)照射轉(zhuǎn)移性LN，消融轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)注射T-MP的轉(zhuǎn)移性LN的溫度從27.3℃增加到 54.3℃，明顯高于用nonT-MP處理的對照溫度(46.5℃)。48 h后，將照射過的轉(zhuǎn)移性LN切除并用電子顯微鏡觀察。與nonT-MP組相比，T-MP光熱療法的轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中觀察到更多以細(xì)胞收縮、核破裂和固縮為特征的死亡腫瘤細(xì)胞。同時，通過監(jiān)測腫瘤的生長復(fù)發(fā)和小鼠的存活率發(fā)現(xiàn)，與nonT-MP相比，當(dāng)用T-MP輔助激光照射治療轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)時，腫瘤復(fù)發(fā)受到顯著延遲和抑制，且小鼠的生存期顯著延長(中位生存期為96天)。這種治療結(jié)果與腫瘤切除加淋巴結(jié)清掃術(shù)的傳統(tǒng)治療的效果相當(dāng)甚至更好，后者獲得了91天的中位生存期，證明了這種局部微創(chuàng)治療的優(yōu)勢。

圖5. 轉(zhuǎn)移性LN的光熱療法和抗腫瘤效果評估。(A) 圖示在第0天對原位腫瘤的手術(shù)切除腫瘤并光熱治療轉(zhuǎn)移LN。(B) 使用Testo 890熱成像儀記錄轉(zhuǎn)移性LN的光熱升溫。(C) 光熱治療后LN的TEM圖像。(D) 腫瘤切除前(第0天)以及腫瘤切除和光熱治療后小鼠的生物發(fā)光成像。(E) 圖D生物發(fā)光強(qiáng)度統(tǒng)計。(a) T-MP+激光 vs. nonT-MP+激光；(b) nonT-MP+激光 vs. T-MP、nonT-MP和腫瘤切除術(shù)。(c) T-MP+Laser vs. 除nonT-MP+Laser之外的所有其他對照。(F) 小鼠的生存曲線。(G) 小鼠體重。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。(n=5)。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。

作者簡介

方超

本文通訊作者

▍主要研究領(lǐng)域

主要從事腫瘤靶向遞藥系統(tǒng)研究。

▍主要研究成果

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師，癌基因與相關(guān)基因國家重點實驗室PI，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院虹橋國際醫(yī)學(xué)研究院PI。代表性成果在Adv Sci、Adv Funct Mater、Nano Lett、Small、ACS Nano等發(fā)表，申請和授權(quán)發(fā)明專利14項(PCT專利1項)，主持國家自然科學(xué)基金項目6項。

▍Email:?fangchao32@sjtu.edu.cn

孫鵬

本文共同通訊作者

▍主要研究領(lǐng)域

胃腸道腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移治療的基礎(chǔ)和臨床研究、胃腸道腫瘤圍手術(shù)期加速康復(fù)外科措施的管理和實施。

▍主要研究成果

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院普外科主任醫(yī)師、行政主任，上海市醫(yī)學(xué)重點專科學(xué)術(shù)帶頭人。近年來專注于術(shù)中熒光導(dǎo)航淋巴結(jié)清掃技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化，完成熒光導(dǎo)航下的胃腸道腫瘤淋巴結(jié)清掃手術(shù)百余例。研究成果在J Hepatol、Hepatology等期刊上發(fā)表。

▍Email:?sp2082@shtrhospital.com

馮海一

本文第一作者

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 博士后

▍主要研究領(lǐng)域

腫瘤淋巴靶向治療遞藥系統(tǒng)。

袁一航

本文共同第一作者

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 博士研究生

▍主要研究領(lǐng)域

胃腸道腫瘤靶向治療的納米技術(shù)研發(fā)。

撰稿：原文作者

編輯：《納微快報(英文)》編輯部

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