目前，在明顯早產(chǎn)兒研究中，關于塑造腸道微生物組發(fā)展的宿主和環(huán)境因素不太明確。在足月嬰兒中，出生方式和接受母乳是影響第一年腸道微生物組的主要因素，但關于早產(chǎn)兒的相關研究產(chǎn)生了不一致的結果。在沒有壞死性小腸結腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）或晚發(fā)性敗血癥（necrotizing enterocolitis，LOS）等腸道疾病的情況下，需要對影響早產(chǎn)兒正常腸道微生物組結構（preterm gut community types，PGCTs）和功能的因素進行重點研究。

早產(chǎn)兒最初在新生兒重癥監(jiān)護室（neonatal intensive care unit，NICU）接受護理，這個獨特的環(huán)境在腸道微生物組的獲得和發(fā)展中起著關鍵作用。在早產(chǎn)兒中，探索益生菌對腸道微生物群發(fā)育影響的研究很少，但有研究已經(jīng)表明雙歧桿菌屬能夠在腸道內(nèi)長期定居。本研究中，對沒有腸道疾病或LOS的早產(chǎn)兒進行研究，目的是：（1）表征早產(chǎn)兒腸道微生物組在NICU期間的縱向發(fā)育特點。（2）確定協(xié)變量對早期生命關鍵時期發(fā)育中的細菌群落和功能的影響。

2022年9月,美國芝加哥大學Christopher J. Stewart、Janet E Berrington課題組在Nature Microbiology(IF:30.964)發(fā)表了題為“Strain-specific impacts of probiotics are a significant driver of gut microbiome development in very preterm infants”的文章，作者以早產(chǎn)兒糞便為研究對象，運用宏基因組、轉錄組學、非靶向代謝組學等組學研究方法重點闡述了益生菌對菌株的特異性影響對早產(chǎn)兒腸道微生物組發(fā)育的影響，其中一些與影響足月嬰兒的因素重疊。結果突出了益生菌產(chǎn)品中菌株特異性差異的重要性，及其對早產(chǎn)兒腸道中宿主的相互作用影響。

研究思路

主要內(nèi)容

首先對123名妊娠<32周出生的極早產(chǎn)兒中縱向收集的1431個樣本進行了宏基因組分析，大多數(shù)嬰兒（92.7%）在某個時候會接受一些母乳（mothers’ own milk，MOM），隨著年齡的增長，嬰兒開始接受配方奶粉。所有樣本都曾接觸過奶（MOM、配方奶或兩者都有，圖1a）和抗生素。為了包括益生菌引入前的嬰兒，本研究中的隊列是在10年內(nèi)收治的，涵蓋了益生菌引入前和兩次連續(xù)使用益生菌期間。實驗中，一組沒有接觸益生菌，兩組分別給予不同的益生菌產(chǎn)品：Infloran（雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌）或Labinic（雙歧桿菌、長芽孢桿菌亞種和嗜酸乳桿菌）。

1.分類概述

總共在樣品中鑒定出394種細菌。物種豐富度在出生后前10天略有下降，這與需氧細菌的損失相對應（圖1b）。第十天之后，物種豐富度持續(xù)增加，直到嬰兒離開NICU。此外，香農(nóng)多樣性從出生時到第45天呈指數(shù)增長，從第45天開始略有增加（圖1b）。從出生到第80天，專性厭氧菌的相對豐度普遍增加（圖1c）。雙歧桿菌（放線菌門）的相對豐度從出生到出院逐漸增加，從第30天開始是最豐富的屬。埃希氏桿菌屬和克雷伯氏桿菌屬，都是革蘭氏陰性菌變形菌門的生物，在出生后第一個月相對豐度增加，然后逐漸下降（圖1d,e,f）。根據(jù)狄利克雷的細菌物種多項式混合物（Dirichlet’s multinomial mixture，DMM）模型確定了五個簇是最佳的，在本研究中它們稱為PGCTs，PGCT根據(jù)該簇內(nèi)樣品的平均年齡編號為1-5。

圖1| 對早產(chǎn)兒出生前120天的飲食和腸道微生物群的描述性概述（n=1431）

2.塑造早產(chǎn)腸道微生物組的因素

抗生素、MOM、母乳強化劑（breast milk fortifier，BMF）和益生菌在一個或多個時間點與細菌分類顯著相關（圖2a）。益生菌在統(tǒng)計學上是最顯著的，在所有時間點上都與細菌群落相關。對微生物組功能代謝能力的補充分析（complementary analysis）顯示，在第10-14天、第25-29天、第30-34天、第35-39天和第50-69天，只有益生菌顯著相關（圖2b）。

圖2| 12個臨床協(xié)變量在不同時間點的顯著性和解釋方差

3.益生菌在塑造腸道群落中的作用

二項混合效應模型顯示，未接受益生菌的嬰兒的腸道菌群更有可能過渡到富含克雷伯氏菌的PGCT-3，這與出生時較低的胎齡有關（圖3a）。接受Infloran和接受Labinic的嬰兒則更有可能分別過渡到PGCT-5和PGCT-4（圖3a）。與不接受益生菌的嬰兒相比，接受Labinic的嬰兒的香農(nóng)多樣性和總體微生物組譜顯著更高，進一步證明了不同益生菌的影響（圖3c,d）。與從未接受益生菌治療的DOL（day of life）匹配嬰兒相比，在服用益生菌之前、期間和之后，益生菌種類明顯更普遍（圖3e）。根據(jù)分類圖譜，在任何時間點上，益生菌是唯一與整體功能酶（Enzyme Commission，EC）概況顯著相關的協(xié)變量（圖2b）。益生菌組相互之間的差異比不服用益生菌組的分類組成更不同（圖3d），與之不同的是，服用兩種產(chǎn)品的嬰兒的功能圖譜比從未服用益生菌的嬰兒的功能圖譜更相似（圖3f），無論使用哪種益生菌，其功能都是相似的。

圖3| 益生菌是與早產(chǎn)兒微生物組相關的最顯著的協(xié)變量

4.非靶向代謝組學+轉錄組研究早產(chǎn)兒腸道微生物結構

PGCTs的總體組成存在顯著差異（圖4a）。為進一步探索PGCTs的功能影響，作者選擇了代表每種PGCT的10個糞便樣本的子集和匹配的血清樣品進行非靶向代謝組學。結果發(fā)現(xiàn)，基于PGCT的樣品之間的糞便代謝物譜存在顯著差異（圖4b），而相匹配的血清代謝物譜中則沒有（圖4c）。在糞便中發(fā)現(xiàn)，與PGCT-4/-5相比，PGCT-3中存在一種未知代謝物出現(xiàn)顯著富集的情況（補充表5）。血清中，發(fā)現(xiàn)與PGCT-3相比，PGCT-4/-5中的一種代謝物溶血磷脂酰膽堿20:3顯著富集（補充表6）。

為探索每種PGCT的小分子對早產(chǎn)兒上皮屏障功能的影響，采用了妊娠25周早產(chǎn)兒的腸道衍生類器官模型。來自類器官的轉錄組譜揭示了對每種PGCT糞便中上清液的特定宿主反應，PGCT-4和PGCT-5明顯在x軸上聚集（圖4d）。與培養(yǎng)基對照相比，PGCT-4-和PGCT-5暴露的類器官單層中顯示出最多的差異表達基因（differentially expressed genes，DEG）（圖4e），這進一步支持了這一點。通過GO分析對PGCT-4和PGCT-5暴露單層中上調(diào)的基因進行分組，發(fā)現(xiàn)這些DEG參與許多細胞和代謝過程，包括細胞蛋白代謝過程（補充表7）。

圖4| 代謝組學研究早產(chǎn)兒腸道微生物結構

5.通過飲食和抗生素調(diào)節(jié)嬰兒微生物組

與從未接受MOM相比，接受MOM后的香農(nóng)多樣性顯著更高（圖5a），并且在前7 d給予抗生素的樣品中顯著降低（圖5b）。與從未接受過MOM的嬰兒相比，在接受MOM期間和接受MOM之后采集的樣品中，雙歧桿菌的相對豐度顯著較高。在接受MOM期間和之后收集的樣品中，葡萄狀球菌的相對豐度顯著降低（圖5c）。在接受抗生素治療的嬰兒中觀察到相反的趨勢，這些嬰兒在前7天內(nèi)接受抗生素，雙歧桿菌的相對豐度出現(xiàn)顯著降低而葡萄狀球菌的相對豐度出現(xiàn)增加（圖5d）。

圖5| MOM和抗生素與早產(chǎn)腸道微生物組顯著相關

研究討論

在大量縱向采樣的早產(chǎn)兒群體中，益生菌產(chǎn)品的選擇以不同的方式影響腸道微生物組的發(fā)育，加速其向雙歧桿菌屬的轉變。此外，這些PGCTs在其功能含義和與宿主上皮的相互作用方面顯示出差異。本項研究將有助于為設計針對早產(chǎn)兒腸道微生物組的干預試驗提供支持。

小鹿推薦

該研究調(diào)查在離散時間段和使用益生菌之前使用的兩種不同益生菌產(chǎn)品的影響。益生菌產(chǎn)品被確定為在分類和功能水平上塑造細菌群落的主要驅動力。結果表明補充Infloran或Labinic與過渡到兩種不同的富含雙歧桿菌的PGCT（PGCT-4和-5）有關，為了確定PGCT與宿主-微生物相互作用的相關性，對匹配的糞便和血清樣本進行了代謝組學，并使用了實驗性早產(chǎn)兒腸道類器官模型。發(fā)現(xiàn)糞便的代謝物譜與PGCT相關。此外，發(fā)現(xiàn)含有代謝物和糞便其他成分的無菌糞便上清液以PGCT特異性方式影響早產(chǎn)兒上皮反應。這表明在益生菌使用的驅動下，微生物組過渡到不同的PGCT具有相關的功能意義。

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