1.分子手術(shù)刀”--限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶)(1)來源:主要是從原核生物中分離純化出來的。

(2)功能:能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列,并且1/27使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開,因此具有特異性。

(3)結(jié)果:經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段未端通常 有兩種形式:黏性末端和平末端。

2."分子縫合針”一-DNA連接酶

(1)西種DNA連接施(E.coliDNA連接隨和TALDNA連接酶)的比較1相同點:都縫合磷酸二酯鍵。區(qū)別:E coliDNA連接酶來源于T4噬菌體,只能將雙鏈DNA片段互補的黏性未端之間的磷酸二酯鍵連接起來;而T4DNA連接酶能縫合兩 種末端,但連接平末端的之間的效率較低,

(2與DNA聚合酶作用的異同:DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接兩個DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵。

3.'分子運輸車”--載體

1載體具備的條件:①能在受體細胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存。②具有一至多個限制酶切點,供外源DNA片段插入。③具有標(biāo)記基因,供重組DNA的鑒定和選擇。

2最常用的體是質(zhì)粒它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨立于細菌染色體之外,并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。

3其它載體:噬菌體、動植物病毒。

（二）基因工程的基本操作程序

第一步:目的基因的獲取

1.目的基因是指:是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因

2.獲取目的基因的方法基因文庫、人工合成、PCR技術(shù)

3.原核基因采取直接分離獲得, 真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。

4.PCR 技術(shù)擴增目的基因

(1)原理:DNA雙鏈復(fù)制

(2)過程:第一步:加熱至90~95℃DNA解鏈;第二步:冷卻到55~60℃,引物結(jié)合到互補DNA鏈;第三步:加熱至70~75℃,熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補鏈的合成,

第二步:重組DNA分子

1.目的:使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳至下一代,使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。

2組成:目的因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因+復(fù)制原點

1)啟動子:是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合 ”識別和結(jié)合的音部位,能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA.最終獲得所需的蛋白質(zhì)。

(2)終止子:也是一段有特殊結(jié) 構(gòu)的DNA片段,位于基因的尾端。

(3)標(biāo)記基因的作用:是為了鑒定受體細胞中是否含有的基因,從而將含有目的基因的細胞篩選出來。常用的標(biāo)記基因是抗生素基因。

第三步:轉(zhuǎn)化受體細胞