百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，自2014年瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的Picotti和她的研究小組開(kāi)始用Lip-SRM法測(cè)量復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的大量結(jié)構(gòu)改性蛋白質(zhì)以來(lái)[1]；該研究小組隨后對(duì)方法進(jìn)行改進(jìn)，研究了復(fù)雜細(xì)胞基質(zhì)中幾種生物蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，并推翻長(zhǎng)期以來(lái)關(guān)于蛋白變性的定論，提出蛋白質(zhì)變性全新理論[2]；該研究小組又以該技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞中的蛋白和小分子代謝之間之前未知的相互作用。

1. 代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享—前言

生物體的各項(xiàng)生命活動(dòng)以體內(nèi)分子間的相互作用為基礎(chǔ)，如蛋白合成過(guò)程中，蛋白和DNA間、蛋白和蛋白間以及蛋白和RNA間的相互作用[3]；除此之外，小分子代謝物對(duì)于許多蛋白來(lái)說(shuō)是非常重要的調(diào)節(jié)因子，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、新陳代謝和蛋白翻譯過(guò)程中起著重要作用。但是，人們一直致力于研究蛋白與生物大分子間的相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)與小分子物質(zhì)間相互作用的研究相對(duì)滯后。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，隨著近幾年質(zhì)譜儀、高通量蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)的興起，一項(xiàng)涉及生物分子之間的相互作用的新組學(xué)-相互作用組學(xué)(interactomics)也進(jìn)一步發(fā)展，這也預(yù)示著生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)藥領(lǐng)域的改變[4]。

目前，對(duì)蛋白和代謝物間的相互作用主要基于一些特定類(lèi)型(如催化)的相互作用或檢測(cè)小蛋白片段與代謝物間的相互作用，需要對(duì)代謝物進(jìn)行化學(xué)修飾或選取某些特定類(lèi)型的化合物。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，因此，Paola Picotti課題組利用代謝物與蛋白結(jié)合會(huì)引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)了新的Limited (or native) proteolysis-small molecule mapping(LiP-SMap)法用于研究小分子代謝物和蛋白之間的相互作用，并開(kāi)始在全蛋白組水平上系統(tǒng)地分析和定量了蛋白與代謝物間的相互作用，并建立了它們之間的關(guān)系。

2.代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享—LiP-SMap法技術(shù)路線與方法驗(yàn)證

如圖1，與之前的Lip-SRM法[1,5]類(lèi)似，首先在非變性的條件下提取蛋白質(zhì)，然后將提取的蛋白分為兩組，一組加入小分子代謝物，讓其與蛋白質(zhì)相互作用，另一組不進(jìn)行任何處理；再加入廣譜的蛋白酶K(PK)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)特異性蛋白片段；得到的特異片段再經(jīng)序列特異性的Trypsin酶解，最后用LC-MS法定量得到的肽段。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，由于代謝物與蛋白的特異性結(jié)合會(huì)引起蛋白結(jié)構(gòu)的局部改變，從而改變蛋白質(zhì)被PK酶切的表位產(chǎn)生不同的肽組，通過(guò)與對(duì)照組的比較篩選出代謝物與蛋白的作用圖譜，從而找出結(jié)合位點(diǎn)。

圖1 LiP-SMap法技術(shù)路線(A:蛋白提取與酶解; B:肽段序列; C:MS檢測(cè)的肽段信號(hào))

為驗(yàn)證該技術(shù)的可靠性，選取有已知蛋白與代謝物作用位點(diǎn)的腺苷三磷酸(ATP)、苯丙氨酸(L-Phe)和磷酸烯醇式苯酮酸(PEP)3個(gè)物質(zhì)進(jìn)行研究，并加入E.coli的蛋白提取液中；代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，還用該方法篩選酵母細(xì)胞中與淺藍(lán)菌素結(jié)合的位點(diǎn)Fas2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3. 代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享—大腸桿菌中的代謝物-蛋白質(zhì)

互作網(wǎng)絡(luò)和結(jié)合位點(diǎn)分析

選擇E.coli作為研究對(duì)象，分別使用20種(圖2A,8個(gè)中心碳代謝相關(guān)代謝物，4個(gè)氨基酸，7個(gè)核苷磷酸和1個(gè)環(huán)腺苷單磷酸)不同的代謝中間產(chǎn)物檢測(cè)其與大腸桿菌蛋白的相互作用。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，共檢測(cè)到1,678個(gè)代謝物-蛋白質(zhì)的相互作用，其中1,447個(gè)未被報(bào)道過(guò)(圖2B)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)很多新相互作用與有機(jī)酸和糖磷酸鹽相關(guān)。

此外，將檢測(cè)到的代謝物-蛋白作用和BRENDA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)該檢測(cè)方法的假陽(yáng)性率不超過(guò)5.5%(有些新發(fā)現(xiàn)的作用由于未在數(shù)據(jù)庫(kù)中，也被認(rèn)為是假陽(yáng)性結(jié)果)。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，為評(píng)估相互作用結(jié)果的可信度，該團(tuán)隊(duì)也開(kāi)發(fā)了STAR法對(duì)相互作用進(jìn)行打分(圖2C)。

該團(tuán)隊(duì)通過(guò)測(cè)定Protein Data Bank Ligand Expo數(shù)據(jù)庫(kù)中收集的代謝物蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，提供了基于高通量蛋白組水平的代謝物結(jié)合位點(diǎn)的譜圖信息(圖2D)。

圖2.代謝物與蛋白相互作用圖(A:中心碳代謝網(wǎng)絡(luò)圖; B:基于LiP-SMap檢測(cè)出的作用位點(diǎn); C:1,678個(gè)LiP-SMap相互作用位點(diǎn)的得分分布; D：以GTP為代表的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu))

4. 代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享—代謝物和蛋白相互作用特征與新調(diào)節(jié)方式發(fā)現(xiàn)

通過(guò)分析代謝物敏感的蛋白與E.coli的“核心蛋白組”之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，代謝物更傾向于與濃度隨時(shí)間的變化較小或保持不變的蛋白結(jié)合(圖3A)。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，這也可能預(yù)示在細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性過(guò)程中，代謝物-蛋白的結(jié)合與蛋白濃度的變化是兩條互補(bǔ)的途徑。

代謝物通過(guò)變構(gòu)、催化或配體誘導(dǎo)等方式實(shí)現(xiàn)酶的活性調(diào)控，那么是不是還有新的作用方式呢？該團(tuán)隊(duì)又選取幾個(gè)參與中心碳代謝的代謝物與酶(檸檬酸與磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶Ppc，果糖-1,6-二磷酸FBP與磷酸烯醇式丙酮酸合酶調(diào)控蛋白PpsR, FBP與果糖-6-磷酸脫氫酶)的相互作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)代謝物通過(guò)間接的方式調(diào)控酶的變構(gòu)從而調(diào)節(jié)酶的活性(圖3B,C)。

圖3 代謝物和蛋白相互作用特征(A, 左:至少有一個(gè)代謝物結(jié)合位點(diǎn)的蛋白的累積變異系數(shù)曲線; 右: 排除與ATP、GTP和Citr.結(jié)合位點(diǎn)的蛋白的累積變異系數(shù)曲線; 橙:改性蛋白, 黑:非改性蛋白)與新調(diào)節(jié)方式發(fā)現(xiàn)(B,C: PpsA活性測(cè)定)

5. 代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享—代謝物與蛋白在催化位點(diǎn)的相互作用

為研究催化活性或競(jìng)爭(zhēng)性抑制，該團(tuán)隊(duì)首先分析了大腸桿菌蛋白晶體結(jié)構(gòu)信息，發(fā)現(xiàn)活性位點(diǎn)中代謝物與異構(gòu)肽段的距離為6.44埃(圖3A)，并將6.44埃認(rèn)為是活性位點(diǎn)作用范圍，大于6.44埃的遠(yuǎn)端位點(diǎn)可能是變構(gòu)位點(diǎn)或其他催化位點(diǎn)(圖3B,C)。

接著，對(duì)1,665個(gè)異構(gòu)肽段的分析，發(fā)現(xiàn)37%的肽段是與已知化合物結(jié)合的活性位點(diǎn)，其中有部分位點(diǎn)理論上能與催化中心形成氫鍵(圖3D)。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，此外，也發(fā)現(xiàn)有多個(gè)代謝物結(jié)合位點(diǎn)的酶大都具有氧化脫氫酶活性或參與涉及磷酸轉(zhuǎn)移的反應(yīng)(圖3E)。

此外，該團(tuán)隊(duì)也通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，LiP-SMap法能用于鑒定新的酶-底物相互作用和競(jìng)爭(zhēng)性抑制位點(diǎn)。

圖4 代謝物與蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的分析(A: 酶-代謝物復(fù)合物結(jié)構(gòu)活性位點(diǎn)中所有檢測(cè)到的肽段與變構(gòu)肽段的最小距離分布; B and C: 活性位點(diǎn)分布; D: 活性位點(diǎn)和遠(yuǎn)端位點(diǎn)分布; E: 代謝物與酶結(jié)合位點(diǎn)分布,綠色-結(jié)合位點(diǎn)已知)

6. 代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享—代謝物結(jié)合對(duì)蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的影響和量化指標(biāo)

之前的研究中已經(jīng)有學(xué)者提出代謝物的結(jié)合可引起蛋白復(fù)合物或者聚合物的形成或解離，該團(tuán)隊(duì)也選取162個(gè)蛋白-代謝物對(duì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)約68%的蛋白-代謝物對(duì)變得更加敏感，另外32%抗性增加；另外也發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了代謝物的結(jié)合除引起結(jié)構(gòu)重排、形成同系復(fù)合物或者作為雜合物亞基單元外，也能引起已知蛋白復(fù)合物的組成發(fā)生改變。

最后根據(jù)ATP結(jié)合位點(diǎn)可以對(duì)于ATP的結(jié)構(gòu)反應(yīng)度進(jìn)行區(qū)分的特點(diǎn)，研究組提出了代謝物結(jié)合的量化指標(biāo)in-extract Kds(圖5)；in-extract值在1-10mM范圍內(nèi)時(shí)，有83%蛋白-代謝物相互作用是新發(fā)現(xiàn)的；代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了111個(gè)新低親和位點(diǎn)， in-extract平均值為3.23。這也再次證明LiP-SMap法可直接用于確定復(fù)雜生物樣本中代謝物結(jié)合位點(diǎn)的量化指標(biāo)。

圖5 LiP-SMap法測(cè)定細(xì)胞中代謝物結(jié)合位點(diǎn)親和力

7. 代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享—小結(jié)

本文利用新開(kāi)發(fā)的LiP-SMap法，結(jié)合生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)、代謝組以及蛋白組方法創(chuàng)新性地研究了代謝物-蛋白間的相互作用，并驗(yàn)證了該方法可用于新的變構(gòu)和催化位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)；同時(shí)也揭示代謝物與蛋白的結(jié)合會(huì)引起蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，該方法簡(jiǎn)單高效，不需要特殊的化學(xué)反應(yīng)或者添加保護(hù)基團(tuán)，可用來(lái)測(cè)定藥物與細(xì)胞蛋白之間的相互作用并確定藥物的作用靶標(biāo)，為制藥行業(yè)的研究提供了一種新的有效工具。

代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享—參考文獻(xiàn)：

[1] Yuehan Feng, etal Global analysis of protein structural changes in complex proteomes. Nat Biotechnol.2014 Oct;32(10):1036-44.

[2] Leuenberger P , et al. Cell-wide analysis of Protein thermal unfolding reveals determinants of thermostability.Science.2017 Feb 24;355(6327).

[3] Tagore R, et al. A Global Metabolite Profiling Approach to Identify Protein-Metabolite Interactions. J Am Chem Soc.2008 Oct 29;130(43):14111-3.

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[5] Schopper S, et al. Measuring protein structural changes on a proteome wide scale using limited proteolysis-coupled mass spectrometry. Nat Protoc.2017 Nov;12(11):2391-2410.