2022年2月，來自復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院的張?zhí)煊詈婉R競團隊在?Clinical and Translational Medicine?雜志上合作發(fā)表了題名為“Single-cell transcriptomics reveals pathogenic dysregulation of previously unrecognised chondral stem/progenitor cells in children with microtia”的論文，該研究通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，系統(tǒng)地注釋了人類耳廓軟骨中的軟骨相關(guān)細胞亞型，首次鑒定了軟骨層中存在未報道的成體軟骨干/祖細胞（CSPCs）以及其調(diào)控紊亂在先天性小耳畸形發(fā)生中的關(guān)鍵作用。該研究中的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)由博奧晶典提供。

【發(fā)表期刊】Clinical and Translational Medicine

【發(fā)布時間】2022年2月

【影響因子】11.492

【檢測技術(shù)】單細胞轉(zhuǎn)錄組測序、免疫熒光、免疫組化

研究背景

先天性小耳畸形是顱面部第二大出生缺陷，由外中耳的發(fā)育不良引起，對兒童的生理和心理發(fā)育都有不良影響。然而，目前的治療方式一直存在局限性，病因和發(fā)病機制也尚不明確。

研究路線

研究結(jié)果

1.人耳廓軟骨的 scRNA-seq

該研究對3例小耳畸形兒童和6例正常對照（2名兒童和4名成人）的耳廓軟骨進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析，共獲得47214個細胞的轉(zhuǎn)錄組信息，鑒定為7種細胞類型，其中有4種軟骨相關(guān)的細胞類型，包括軟骨干/祖細胞（CSPCs）、軟骨細胞（Chonds）、基質(zhì)干細胞/祖細胞（SSPCs）以及基質(zhì)細胞（SCs）。通過擬時間軌跡分析發(fā)現(xiàn)，CSPCs 分化為 Chonds（軟骨譜系）而 SSPCs 分化為 SCs（基質(zhì)譜系）。作者結(jié)合免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)，SSPCs 特異性地位于過渡層和內(nèi)軟骨膜，CSPCs 特異性地位于軟骨層和過渡層，該發(fā)現(xiàn)與先前已發(fā)表的軟骨膜干細胞的描述不同。

2.軟骨譜系和基質(zhì)譜系的亞組分析

該研究分別對軟骨譜系和基質(zhì)譜系進行了亞組分析。作者發(fā)現(xiàn)軟骨譜系中有4種亞型，CSPCs 先進展到早期軟骨細胞（ECs），再從中間軟骨細胞（ICs）到晚期軟骨細胞（LCs）。CSPCs 中高表達干細胞標記物、軟骨細胞分化和細胞外基質(zhì)（ECM）的相關(guān)基因，但這些基因的表達從 ECs 到 LCs 逐漸下調(diào)，而軟骨退化相關(guān)基因從 CSPCs 到 LCs 逐漸上調(diào)。作者在基質(zhì)譜系中發(fā)現(xiàn)了3種亞型，通過 GO 功能富集分析發(fā)現(xiàn)，SC1 可能主要負責與軟骨組織外其他類型細胞的通訊，而 SC2 可能輔助軟骨形成。接下來，作者通過 SCENIC 方法構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，確定了4個主要的調(diào)控子，包括 CSPCs 的 SOX8 調(diào)控子、 ECs 的 NFATC2 調(diào)控子、ICs 和 LCs 的 SOX9 調(diào)控子以及基質(zhì)譜系的 FOXP1 調(diào)控子。

3.年齡對軟骨譜系影響的綜合分析

為了研究年齡對軟骨譜系的影響，作者對正常對照組中不同年齡的軟骨譜系進行了比較，發(fā)現(xiàn)兒童中 CSPCs 和 ECs 的比例較高，而 ICs 和 LCs 的比例較低。成人的軟骨譜系中上調(diào)和下調(diào)的 DEGs 分別與衰老和 ECM 的形成相關(guān)。此外，作者發(fā)現(xiàn)所有亞型細胞的 DEGs 顯著富集于 Aging Atlas 和 GenAge 數(shù)據(jù)庫中。在成人軟骨譜系的所有亞型中，作者發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子 CEBPB 與和其互作分子 CEBPD 的表達及調(diào)控活性的上調(diào)。通過基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（GRN）分析證實，CEBPB 和 CEBPD 靶向上調(diào)的 DEGs 與衰老相關(guān)。

4.先天性小耳畸形軟骨譜系細胞亞型特異性基因表達譜

接下來，作者探索了軟骨譜系的異常在先天性小耳畸形發(fā)生中的作用，發(fā)現(xiàn)與其它細胞亞型相比，小耳畸形兒童中 CSPCs 的比例顯著降低低；CSPCs 的功能異常程度最大；轉(zhuǎn)錄因子的失調(diào)只出現(xiàn)在 CSPCs 中。這些提示 CSPCs 可能是小耳畸形發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為了確定 CSPCs 中哪些轉(zhuǎn)錄因子的失調(diào)可能是疾病的潛在致病機制，作者通過 PageRank 算法發(fā)現(xiàn)在下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子中，SOX8 得分最高，表達下降幅度最大，其靶基因和 ECM 組成和軟骨發(fā)育過程相關(guān)。而在上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子中，EGR1 顯示出高的差異表達和 PageRank 評分，其靶基因主要參與氧化應(yīng)激發(fā)應(yīng)。最后，作者通過免疫組化實驗證實，小耳畸形 CSPCs 中 SOX8 蛋白表達下降，EGR1 蛋白表達增加。

研究結(jié)論

本研究通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序系統(tǒng)地注釋了人類耳廓軟骨中的軟骨相關(guān)細胞亞型。本研究還首次描述了軟骨層中的 CSPCs，可能具有定向軟骨細胞分化的潛力，并發(fā)現(xiàn)了 CSPCs 中轉(zhuǎn)錄因子 SOX8 和 EGR1 的失調(diào)可能通過影響軟骨發(fā)育和氧化應(yīng)激反應(yīng)從而導致先天性小耳畸形的發(fā)生。這一發(fā)現(xiàn)為進一步探索小耳畸形的發(fā)病機制奠定了理論基礎(chǔ)，并為潛在的治療提供了新的途徑。
參考文獻：

Ma J, Zhang Y, Yan Z, et al. Single-cell transcriptomics reveals pathogenic dysregulation of previously unrecognised chondral stem/progenitor cells in children with microtia.?Clin Transl Med?2022;12(2): e702.