前言

2022年11月15日，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院吳國(guó)豪團(tuán)隊(duì)聯(lián)合中國(guó)科學(xué)院上海營(yíng)養(yǎng)與健康研究所丁秋蓉團(tuán)隊(duì)于Cell Discovery（IF：38.079）在線(xiàn)發(fā)表了免疫細(xì)胞群在癌癥相關(guān)脂肪消耗中的最新研究成果，研究介紹了人類(lèi)脂肪組織的細(xì)胞圖譜，并揭示了惡病質(zhì)患者中脂肪祖細(xì)胞和免疫細(xì)胞的細(xì)胞分布和功能分子特征的顯著變化。

基本信息

期刊：Cell Discovery

影響因子：38.079

發(fā)表年月：2022-11-15

材料：4例CAC患者和4例非CAC患者，取皮下脂肪組織（SAT）和內(nèi)臟脂肪組織（VAT）的血管基質(zhì)部分（SVFs）進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序

方法：10xGenomics單細(xì)胞3端測(cè)序

研究背景

癌癥相關(guān)性惡病質(zhì) （CAC） 是一種病因復(fù)雜的綜合征，其特征是骨骼肌和脂肪組織明顯耗竭。CAC患者常表現(xiàn)為食物攝入量減少，能量消耗升高，分解代謝過(guò)剩和全身炎癥。CAC會(huì)影響化療和放療的效果，降低生活質(zhì)量并增加死亡率。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)表明，脂肪的減少可能在功能上驅(qū)動(dòng)CAC的肌肉損失。然而，近年來(lái)脂肪組織的單細(xì)胞表征研究主要集中在超重相關(guān)代謝綜合征方面，很少有針對(duì)人體脂肪組織的研究。盡管白色脂肪組織（WATs）在CAC的發(fā)生發(fā)展中具有重要的功能作用，但目前尚無(wú)針對(duì)CAC患者脂肪樣本采用單細(xì)胞策略的研究。

在本研究中，作者利用單細(xì)胞測(cè)序揭示了免疫細(xì)胞群在癌癥相關(guān)脂肪消耗中的關(guān)鍵貢獻(xiàn)。并通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)患有或不患有CAC的患者的白色脂肪組織間質(zhì)血管部分進(jìn)行了細(xì)胞鑒定分析，該研究報(bào)告了脂肪祖細(xì)胞和免疫細(xì)胞的儲(chǔ)存和疾病特異性集群和發(fā)育軌跡。

研究結(jié)果

Result1 脂肪組織中非脂肪細(xì)胞部分的細(xì)胞群圖譜

作者對(duì)4例CAC患者和4例非CAC患者的皮下脂肪組織（SAT）和內(nèi)臟脂肪組織（VAT）的血管基質(zhì)部分（SVFs）進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。通過(guò)其特定的marker基因鑒定出9種主要的細(xì)胞類(lèi)型：祖細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞、血管細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞（圖1a,b）。在細(xì)胞分布上分析發(fā)現(xiàn)CAC患者和非CAC患者在細(xì)胞分布上無(wú)明顯差異（圖1c）。在細(xì)胞類(lèi)型上分析發(fā)現(xiàn)SAT和VAT中的細(xì)胞類(lèi)型存在明顯差異，SAT中含有更多的血管細(xì)胞且CAC患者SAT的免疫細(xì)胞明顯高于VAT（圖1d）。

圖1 I?有無(wú)CAC患病者的脂肪組織SVF中的細(xì)胞鑒定圖譜分析

Result2 皮下脂肪組織和內(nèi)臟脂肪組織中的脂肪祖細(xì)胞簇圖譜

作者對(duì)VAT和SAT中的祖群進(jìn)行了分析，鑒定出7種主要的細(xì)胞群：成脂祖細(xì)胞、內(nèi)臟前脂肪細(xì)胞（vPreA）、皮下前脂肪細(xì)胞（sPreA）、成纖維細(xì)胞、間皮細(xì)胞?樣祖細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞樣、炎癥前體細(xì)胞（圖2a）。擬時(shí)序分析發(fā)現(xiàn)成脂祖細(xì)胞在SAT中的細(xì)胞軌跡分析確定了兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)變：ASC可以分化為sPreA或vPreA和成纖維細(xì)胞，表明sPreA和vPreA在脂肪形成過(guò)程中存在內(nèi)在的差異（圖2b）。使用SCENIC對(duì)SAT和VAT中前脂肪細(xì)胞的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，SAT前脂肪細(xì)胞中FOS、FOSB和ATF3調(diào)控基因的活性顯著升高，與VAT組相比，SAT組中的前脂肪細(xì)胞顯示線(xiàn)粒體功能和脂肪酸代謝增強(qiáng)（圖2c）。通路富集分析也表明，通路富集分析也提示SAT中PPAR信號(hào)通路活性較高，表現(xiàn)為FABP4、FABP5、ANGPTl4、LPL和CD36表達(dá)相對(duì)較高，與觀(guān)察到SAT中祖細(xì)胞多為前脂肪細(xì)胞相一致（圖2d, e）。

圖2 |?脂肪干細(xì)胞和祖細(xì)胞（ASPCs）細(xì)胞圖譜分析

Result3 皮下脂肪組織和內(nèi)臟脂肪組織中脂肪祖細(xì)胞的惡病質(zhì)特異性改變

作者發(fā)現(xiàn)惡病質(zhì)和非惡病質(zhì)患者中的祖細(xì)胞變化存在差異，惡病質(zhì)患者涉及呼吸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的基因的總體表達(dá)量較低（圖3a）。與無(wú)惡病質(zhì)的患者相比，惡病質(zhì)組的vPreA中主要調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的基因明顯減少，包括CEBPB、CEBPD、BMP2和KLF4（圖3b, c）。此外，在非惡病質(zhì)患者的VAT中發(fā)現(xiàn)了注釋為間皮來(lái)源祖細(xì)胞（cluster 10)，它特異性表達(dá)ITLN1和MSLN，間皮細(xì)胞在保持內(nèi)臟腔和脂肪組織處于正常和非炎癥狀態(tài)方面起著重要作用。因此，作者推測(cè)，在惡病質(zhì)患者中，VAT中產(chǎn)生的間皮細(xì)胞的丟失可能導(dǎo)致了惡病質(zhì)相關(guān)的炎癥（圖3d）。

SAT中的cluster 8（也被指定為炎癥祖細(xì)胞）和VAT中的cluster 0被認(rèn)為是惡病質(zhì)特異性簇。作者對(duì)cluster 8中上調(diào)基因的功能分析顯示，趨化因子信號(hào)通路、nod樣受體信號(hào)通路以及補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)顯著富集，表明炎癥反應(yīng)被激活（圖3e）。作者還在惡病質(zhì)患者中觀(guān)察到，腫瘤細(xì)胞分泌的某些蛋白組分至少部分促進(jìn)了祖細(xì)胞趨化因子基因的表達(dá)（圖3f）。

圖3 | 惡病質(zhì)特異性祖細(xì)胞簇的功能特征

Result4 皮下脂肪組織和內(nèi)臟脂肪組織中免疫細(xì)胞簇圖譜

作者對(duì)脂肪組織中的免疫細(xì)胞進(jìn)行了分析鑒定，降維后聚類(lèi)得到19個(gè)細(xì)胞簇，其中T/NK細(xì)胞進(jìn)一步劃分為10個(gè)簇(cluster 0，1，2，3，5，6，7，8，10和11)。SAT和VAT中免疫細(xì)胞組成雖然沒(méi)有表現(xiàn)出顯著差異，但大部分免疫細(xì)胞來(lái)自VAT。此外，VAT的B細(xì)胞和T細(xì)胞的比例更高，而SAT的巨噬細(xì)胞的比例更高。與非惡病質(zhì)患者相比，惡病質(zhì)患者有更多的脂肪浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞，這與觀(guān)察到的脂肪炎癥相一致。作者還發(fā)現(xiàn)一個(gè)具有強(qiáng)大的增殖能力獨(dú)特的T細(xì)胞亞群，它們的細(xì)胞周期標(biāo)記物表達(dá)量要更高。

Result5 巨噬細(xì)胞在惡病質(zhì)患者中表現(xiàn)為促炎性轉(zhuǎn)變，并可能加重脂肪消耗

作者對(duì)巨噬細(xì)胞亞群進(jìn)行分析鑒定，發(fā)現(xiàn)CAC組中免疫細(xì)胞中脂肪組織巨噬細(xì)胞（ATM）PVM、NPVM亞群的比例均下降（圖4a）。在CAC組中，各種趨化因子基因向促炎特征顯著轉(zhuǎn)變，如CCL2,CCL8, S100A8, S100A9, TNF被顯著上調(diào)（圖4c）;而在非CAC組巨噬細(xì)胞中，與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因顯著上調(diào)，如CEBPD和ACSL1（圖4d）。作者還發(fā)現(xiàn)，在CAC發(fā)育過(guò)程中，巨噬細(xì)胞剔除后，e WAT中的體重減輕、脂肪組織重量和脂肪細(xì)胞的體積顯著增加（圖4e, f, g）。

此外，作者使用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體處理小鼠脂肪組織，脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）的表達(dá)和參與脂解的兩個(gè)關(guān)鍵酶激素敏感型脂肪酶（HSL）的磷酸化均降低，表明e WAT中激活的脂解減少（圖4j, k）。在惡病質(zhì)期間促進(jìn)組織分解代謝的眾所周知的細(xì)胞因子中，我們觀(guān)察到在惡病質(zhì)發(fā)展過(guò)程中附睪WAT中IFN - γ的mRNA和蛋白表達(dá)水平均增加，當(dāng)用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體處理時(shí)，IFN - γ的表達(dá)水平恢復(fù)到基礎(chǔ)水平（圖4l, m）。

圖4 I 巨噬細(xì)胞的變化增強(qiáng)了脂肪組織的分解代謝活性

Result6 在惡病質(zhì)患者的內(nèi)臟脂肪組織中，CD8 + T細(xì)胞也表現(xiàn)出促炎特征和增強(qiáng)的細(xì)胞溶解效應(yīng)活性

作者對(duì)T/NK細(xì)胞進(jìn)行了降維聚類(lèi)分析,聚類(lèi)得到17個(gè)群體，T細(xì)胞進(jìn)一步分為16個(gè)亞群，T細(xì)胞包含4種主要的細(xì)胞類(lèi)型（圖5a）。由于捕獲的T細(xì)胞大部分來(lái)源于VAT(圖5c，d)，作者接下來(lái)重點(diǎn)研究VAT在CAC期間免疫微環(huán)境的變化。

作者對(duì)CD8+T細(xì)胞進(jìn)行擬時(shí)序分析，具有更高細(xì)胞毒性的TEMRA出現(xiàn)在軌跡分支的一端，而在另一個(gè)分支中，TRM作為中間狀態(tài)出現(xiàn)，終止于活化的TEM（圖6a）。CD8 + T細(xì)胞的差異基因表達(dá)分析顯示惡病質(zhì)患者中代表活化狀態(tài)的基因表達(dá)顯著升高，包括GZMH、GZMA、NKG7和IFNG（圖6b, c）。對(duì)CD8+ T細(xì)胞中差異基因表達(dá)的GO分析顯示，在CAC患者中，tcr介導(dǎo)的激活相關(guān)基因顯著上調(diào)。而非惡病質(zhì)患者CD8 + T細(xì)胞中，與功能失調(diào)表型和失活狀態(tài)相關(guān)的基因如MT1X、MT1E、IL7R、ZFP36L2等在非惡病質(zhì)患者CD8 + T細(xì)胞中高表達(dá)。此外，作者發(fā)現(xiàn)激活的CD8+ T細(xì)胞在體外對(duì)脂肪細(xì)胞具有促分解代謝功能，表明激活的CD8+ T細(xì)胞可能在惡病質(zhì)發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生更多的IFN-γ并刺激脂肪分解代謝過(guò)程（圖6d-l）。

圖5 |?SVF中NK/T細(xì)胞圖譜分析

圖6 | 惡病質(zhì)和非惡病質(zhì)患者VATCD8+T細(xì)胞的功能分析

Result7 細(xì)胞互作分析預(yù)測(cè),在惡病質(zhì)狀態(tài)下人類(lèi)白色脂肪組織互作組發(fā)生了劇烈的重塑

鑒于VAT中某些免疫細(xì)胞類(lèi)型的組成和功能表型發(fā)生了顯著變化，作者接下來(lái)探討了這種激活狀態(tài)的轉(zhuǎn)變?cè)诙啻蟪潭壬嫌绊懥思?xì)胞通訊。在CAC環(huán)境下，免疫細(xì)胞之間的配體-受體配對(duì)數(shù)量顯著增加，特別是那些涉及巨噬細(xì)胞的細(xì)胞（圖7a）。然后，作者分析來(lái)揭示CAC期間巨噬細(xì)胞的潛在靶細(xì)胞（圖7b），發(fā)現(xiàn)髓系細(xì)胞在表型和功能上有密切聯(lián)系。除了單核細(xì)胞和cDC2Bs外，與其他免疫細(xì)胞類(lèi)型相比，CD8+ T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更廣泛的通信。作者發(fā)現(xiàn)，免疫細(xì)胞之間的相互作用分析表明，在惡病質(zhì)發(fā)育過(guò)程中，巨噬細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞之間存在很強(qiáng)的相互作用（圖7c）。

圖7 | VAT中免疫細(xì)胞的細(xì)胞配體-受體推斷分析

文章總結(jié)

癌癥相關(guān)性惡病質(zhì)（CAC）中相關(guān)脂肪組織的丟失可能是促進(jìn)此病發(fā)生的原因。作者通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)，對(duì)CAC患者和非CAC患者的白色脂肪組織的基質(zhì)血管成分 進(jìn)行了分析。繪制了脂肪祖細(xì)胞的免疫細(xì)胞的細(xì)胞圖譜和發(fā)育軌跡。來(lái)源于CAC患者脂肪組織的脂肪祖細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了明顯的促炎轉(zhuǎn)變，這些細(xì)胞和其之間的相互作用發(fā)生了顯著地重塑，表明了它們?cè)诖傺追矫婢哂袇f(xié)同作用。值得注意的是，活化的CD8+T細(xì)胞特異性地促進(jìn)了惡病質(zhì)患者脂肪組織中IFNG的表達(dá)，并在體外對(duì)脂肪細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的促分解代謝作用；而在CAC動(dòng)物模型中，巨噬細(xì)胞耗竭導(dǎo)致脂肪分解代謝明顯恢復(fù)，惡病質(zhì)減輕。作者的研究揭示了CAC中慢性炎癥和脂肪消耗的致病機(jī)制。

DOI:10.1038/s41421-022-00466-3