結(jié)腸壁由四層組成：最內(nèi)的粘膜層（上皮層）、粘膜下層、固有肌層和最外的漿膜層。哺乳動(dòng)物的腸道上皮是單層柱狀上皮結(jié)構(gòu)，包含吸收型細(xì)胞和分泌型細(xì)胞，分別具有吸收營養(yǎng)和分泌激素、黏液等作用，但由于各種損傷壓力的存在，腸道中的細(xì)胞會(huì)持續(xù)死亡，而新腸上皮細(xì)胞的產(chǎn)生是由腸道干細(xì)胞不斷增殖分化實(shí)現(xiàn)的。在腸道中，腸絨毛之間存在一些內(nèi)陷，稱為隱窩。腸道干細(xì)胞則位于隱窩基底位置，在那里，腸道干細(xì)胞被含有各類信號(hào)因子的環(huán)境所包圍，同時(shí)與腸上皮頂端接觸到的菌群代謝物和食物營養(yǎng)素組成的外環(huán)境，共同塑造了腸干細(xì)胞的上皮側(cè)微環(huán)境。與此同時(shí)，在腸上皮下層存在的眾多微環(huán)境細(xì)胞（包括基質(zhì)細(xì)胞及免疫細(xì)胞等）共同構(gòu)筑了基底側(cè)微環(huán)境。該微環(huán)境的細(xì)胞群產(chǎn)生信號(hào)通路相關(guān)配體和可溶性細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子，調(diào)節(jié)干細(xì)胞的行為。

2023年5月，來自德國BIMSB的Michael Sigal團(tuán)隊(duì)等人在Nature Communications上發(fā)表題為“Establishment of gastrointestinal assembloids to study the interplay between epithelial crypts and their mesenchymal niche”的文章。

本文中，作者通過上皮細(xì)胞與其基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)體外隱窩形成，同時(shí)維持增殖干細(xì)胞以及分化細(xì)胞。使用這種共培養(yǎng)的方式，成功構(gòu)建出了結(jié)腸類器官組裝體，證實(shí)了上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用能促進(jìn)隱窩的形成。

為了研究上皮和基質(zhì)之間的相互作用，作者首先致力于研究模型的構(gòu)建。前期的研究發(fā)現(xiàn)簡單地將原代基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，并不能實(shí)現(xiàn)完美的體外模型，因?yàn)榛|(zhì)細(xì)胞傾向于從基質(zhì)膠中遷移出來并粘附在板底。為了解決這個(gè)難題，作者先構(gòu)建結(jié)腸類器官和正常培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞，再將預(yù)培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞混合到基質(zhì)膠液滴后立刻加入單個(gè)類器官。為了防止基質(zhì)細(xì)胞的遷移，作者將培養(yǎng)物置于軌道振蕩器生長。使用活細(xì)胞熒光成像，能夠跟蹤上皮和基質(zhì)細(xì)胞于不同時(shí)空階段的生長狀態(tài)，在組合培養(yǎng)的第4天，類器官組裝體便形成由緊密連接的基質(zhì)層包圍的隱窩狀結(jié)構(gòu)。同時(shí)由于基質(zhì)細(xì)胞為體內(nèi)的腸隱窩提供了重要的因子，作者猜想上皮隱窩的形成可以由基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的因子單獨(dú)誘導(dǎo)，于是在培養(yǎng)體系中去除了Wnt激活劑，CHIR-99021，R-spondin 1和BMP抑制劑Noggin，發(fā)現(xiàn)在缺少這些因子的條件下的類器官組裝體和全培養(yǎng)基的類器官組裝體結(jié)構(gòu)相當(dāng)，證實(shí)了作者的猜想，于是后期的培養(yǎng)體系均去除了這些因子。

為了證明類器官組裝體和體內(nèi)隱窩的相似性，作者通過化學(xué)誘導(dǎo)和免疫熒光染色等手段，首先發(fā)現(xiàn)了該模型在沒有補(bǔ)充Wnt誘導(dǎo)因子的情況下，存在與體內(nèi)類似的Wnt靶基因-AXIN1干細(xì)胞的分布；接著發(fā)現(xiàn)Yap相關(guān)蛋白的表達(dá)量會(huì)隨著該模型的成熟逐漸降低，這與體內(nèi)保持一致；最后通過免疫熒光圖像和單細(xì)胞RNA測序等方式，發(fā)現(xiàn)類器官組裝體有著與體內(nèi)組織類似的細(xì)胞組成，比如存在許多看起來完全分化的杯狀細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞等等，并且可以重現(xiàn)凋亡細(xì)胞向管腔排出的現(xiàn)象。

為了闡明結(jié)腸類器官組裝體中基質(zhì)細(xì)胞的多樣性，作者通過免疫熒光染色首先發(fā)現(xiàn)維持CD31的內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，這四種關(guān)鍵細(xì)胞類型的分布與結(jié)腸組織類似。接著作者針對類器官組合體中非上皮細(xì)胞進(jìn)行RNA測序，發(fā)現(xiàn)了存在結(jié)腸組織中的特絡(luò)細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞。最后，作者使用單分子原位雜交評估了成纖維細(xì)胞群在類器官組裝體中的空間分布，表明該組裝體可以模擬體內(nèi)結(jié)腸隱窩的上皮和間充質(zhì)結(jié)構(gòu)，能概括基質(zhì)細(xì)胞（包括特絡(luò)細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞樣細(xì)胞）的多樣性和空間分布。

由于特絡(luò)細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)對BMP信號(hào)傳導(dǎo)作用相反，作者為了進(jìn)一步鑒定模型中特絡(luò)細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞的功能，使用單分子原位雜交和Q-PCR等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)類器官組裝體的BMP激動(dòng)劑-Bmp2主要在上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的隱窩頂部表達(dá)，逐漸向基部減少，而BMP抑制劑-Grem1表達(dá)在隱窩和基質(zhì)細(xì)胞之間，這些蛋白的分布同樣與結(jié)腸組織類似。

BMP是驅(qū)動(dòng)胃腸道細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素，為了探究該模型在研究上皮和基質(zhì)之間信號(hào)傳導(dǎo)的功能，作者通過兩種基因敲除小鼠分別構(gòu)建結(jié)腸類器官組合體，發(fā)現(xiàn)在BMP信號(hào)缺失的情況下，該模型僅是襯有上皮單層的簡單球體，通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞沒有分化，而在BMP信號(hào)存在的情況下，結(jié)果相反。證實(shí)了BMP信號(hào)傳導(dǎo)對上皮分化的關(guān)鍵作用。

在之前的工作中，作者發(fā)現(xiàn)在早期培養(yǎng)物中，BMP激活劑表達(dá)較低，不存在特絡(luò)細(xì)胞，而BMP抑制劑在基質(zhì)區(qū)域表達(dá)較高，隨著隱窩的成熟，BMP激動(dòng)劑在隱窩頂部表達(dá)增加，而BMP抑制劑卻沒有在隱窩和基質(zhì)細(xì)胞之間表達(dá)，表明BMP信號(hào)傳導(dǎo)與基質(zhì)細(xì)胞組織之間存在潛在關(guān)系。為了驗(yàn)證上述觀點(diǎn)，作者使用BMP處理過原代結(jié)腸基質(zhì)細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞后，通過Q-PCR，發(fā)現(xiàn)特絡(luò)細(xì)胞標(biāo)志物Foxl4和Wnt1a均顯著增加，而滋養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)志物Cd5和Grem34下調(diào)，證實(shí)了基質(zhì)細(xì)胞對BMP信號(hào)的響應(yīng)，說明來自上皮的信號(hào)能決定基質(zhì)細(xì)胞的空間分布。

最后，為了探究該模型在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)上的作用，作者在已成功誘導(dǎo)出小鼠結(jié)腸炎相關(guān)腫瘤的動(dòng)物模型中，取出腫瘤組織，成功構(gòu)建出結(jié)腸癌組裝體，通過HE染色和免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)該組裝體與類器官形態(tài)不同，組裝體的細(xì)胞生長成不規(guī)則的脊，具有高增殖低分化的特點(diǎn)，類似于體內(nèi)的腫瘤組織。作者還發(fā)現(xiàn)該組裝體與腫瘤組織中YAP1的高表達(dá)，表示兩者具有類似胎兒的更加原始狀態(tài)。這些結(jié)果表明該類器官組裝體能模擬結(jié)腸癌的形態(tài)特征，并用于研究腫瘤與其微環(huán)境之間的相互作用。

總而言之，作者開創(chuàng)了一種上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)方式，可以研究胃腸道組織的細(xì)胞間通訊和自組織，上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間相互作用的信號(hào)通路，同時(shí)由于該組裝體在解剖學(xué)上比傳統(tǒng)類器官更接近和更全面地類似于體內(nèi)狀態(tài)，這對胃腸道疾病的研究提供了更加優(yōu)秀的模型，為相關(guān)腫瘤疾病的臨床治療提供了新的思路。