看著個(gè)就夠了-HPLC中常見的異常峰型總結(jié)

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HPLC中常見的異常峰型及其與HPLC色譜柱的關(guān)系

在HPLC分析過程中，由于各種原因，經(jīng)常會出現(xiàn)一些異常峰形，嚴(yán)重影響分析結(jié)果，給實(shí)驗(yàn)者帶來很大的困擾。在這里介紹了一些常見的峰形狀和可能的原因，我們將了解它們是否與HPLC柱有關(guān)。
1、無峰值
可能的原因：
a、進(jìn)樣不成功，或樣品未溶解在溶劑中，或樣品分解變質(zhì)或樣品濃度過低；
b、液相色譜儀本身的問題：泵或檢測器故障；
C、流動相選擇不當(dāng)。比如反相硅膠柱，如果流動相極性太大，一些小的極性物質(zhì)就洗不掉，這些物質(zhì)殘留在柱子里，就不會出峰；
d、探測器不合適。例如，有些產(chǎn)品沒有紫外線吸收或吸收很弱，但使用紫外線檢測器進(jìn)行檢測。
2、平頭峰
可能的原因：
a、樣品濃度過大或進(jìn)樣量過大，也是主要原因；
b、液相色譜的檢測器設(shè)置不正確。
3、負(fù)峰
可能的原因：
a、流動相吸收背景值過高；
b、采樣過程中有空氣進(jìn)入；
C、樣品組分的吸收低于流動相的吸收；
d、所制備樣品的溶劑與流動相不一致。
4、肩峰
可能的原因：
a、進(jìn)樣量過大，樣品濃度過高；
b、保護(hù)柱或柱頭堵塞；
C、保護(hù)柱或色譜柱被污染或失效；
d、柱頭塌陷。
5、分叉峰
可能的原因：
a、溶劑效應(yīng)：用于溶解樣品的溶劑與初始流動相的極性相差太大；
b、保護(hù)柱或柱頭堵塞；
C、保護(hù)柱或色譜柱被污染或失效；
d、柱頭塌陷。
6.鬼峰
可能的原因： 鬼峰出現(xiàn)在某個(gè)光譜中，做同樣的條件后可能不會再出現(xiàn)。有時(shí)沒有峰值。
a、對于進(jìn)樣閥的殘留峰，每次進(jìn)樣后要花足夠的時(shí)間平衡和清潔系統(tǒng)；
b、樣品中存在未知物，改善樣品的前處理；
C、如果流動相被污染，更換新的流動相（或更換品牌）；盡量準(zhǔn)備現(xiàn)用，再次使用時(shí)過濾過夜流動相；
d、流道內(nèi)有小氣泡，打開吹掃閥增加流量消除。
7、凸峰
可能的原因：
a、進(jìn)樣量或樣品濃度高；
b、溶解樣品的溶劑比流動相極性更大；
C、保護(hù)柱或色譜柱被污染或失效；
d、如果流動相不合適，更換新的（調(diào)整pH值或改變類型、比例等）。
8、拖尾峰
可能的原因：
a、進(jìn)樣量或樣品濃度高；
b、如果流動相不合適，更換新的（調(diào)整pH值或改變類型、比例等）；
C、硅烷醇作用：加入三乙胺，用堿誘導(dǎo)鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度，降低流動相的pH值，鈍化樣品；
d、柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效：更換燒結(jié)不銹鋼，增加在線過濾器，過濾樣品；
e、柱頭塌陷或柱效降低：更換色譜柱。

異常的色譜峰指的是色譜圖中的無峰或出現(xiàn)負(fù)峰、寬峰、雙峰、肩峰、峰形不對稱等情況。一般來說，異常峰是實(shí)驗(yàn)工作中較為棘手的問題。異常峰的出現(xiàn)會影響色譜分析的結(jié)果。通常情況下，峰型問題是由分離系統(tǒng)所決定的。在做液相過程中，我們就是要變換不同的條件來改善不好的峰型，對于各種各樣的異常峰，要區(qū)別對待，從主要問題出發(fā)，一個(gè)一個(gè)加以解決。

　　1.色譜圖中未出峰

　　系統(tǒng)未進(jìn)樣或樣品分解;泵未輸液或流動相使用不正確;檢測器設(shè)置不正確

　　2.一個(gè)峰或幾個(gè)峰是負(fù)峰

　　流動相吸收本底高;進(jìn)樣過程中進(jìn)入空氣;樣品組分的吸收低于流動相。

　　3.所有峰均為負(fù)峰

　　信號電纜接反或檢測器輸出極性設(shè)置顛倒;光學(xué)裝置尚未達(dá)到平衡。

　　4.所有峰均為寬峰

　　系統(tǒng)未達(dá)到平衡;溶解樣品的溶劑極性比流動相差很多;色譜柱尺寸及類型選擇不正確;色譜柱或保護(hù)柱被污染或柱效降低;溫度變化造成的影響。

　　5.所出峰比預(yù)想的小

　　樣品黏度過大;進(jìn)樣品故障或進(jìn)樣體積誤差;檢測器設(shè)置不正確.定量環(huán)體積不正確;檢測池污染;檢測器燈出現(xiàn)問題。

　　6.出現(xiàn)雙峰或肩峰

　　進(jìn)樣量過大;樣品濃度過高;保護(hù)柱或色譜柱柱頭堵塞;保護(hù)拄或色譜柱污染或失效;柱塌陷或形成短通道。

　　7.前伸峰

　　進(jìn)樣量或樣品濃度高，溶解樣品的溶劑較流動相極性強(qiáng);保護(hù)柱或色譜柱污染或失效。

　?、僦鶞氐停荷咧鶞?②樣品溶劑選擇不恰當(dāng)：使用流動相作為樣品溶劑;③樣品過載：降低樣品含量;④色譜柱損壞：更換柱子。

　　8.拖尾峰

　　柱超載，降低樣品量;增加柱直徑采用較高容量的固定相;峰干擾，對樣品進(jìn)行清潔過濾;調(diào)整流動相;硅羥基作用，加入三乙胺，用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相pH值;柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效，更換燒結(jié)不銹鋼;加在線過濾器，對樣品進(jìn)行過濾;死體積或柱外體積過大，將連接點(diǎn)降至谷值;盡可能使用內(nèi)徑較細(xì)的連接管;柱效下降，更換柱子;采用保護(hù)柱，對柱子進(jìn)行再生。

　　9.出現(xiàn)平頭峰

　　檢測器設(shè)置不正確;進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高。

　　10.出現(xiàn)鬼峰

　　進(jìn)樣閥殘余峰，可能為上次樣品的殘余。在每次進(jìn)完樣后用充足的時(shí)間來平衡和清洗系統(tǒng);樣品中存在未知物，改進(jìn)樣品的預(yù)處理;流動相污染，更換新流動相，盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用，隔夜的流動相再次使用時(shí)要過濾;盡可能使用HPLC級試劑;流路中有小的氣泡，打開Purge閥，加大流速排除。

　　11.峰分叉

　?、俦Ｗo(hù)柱或分析柱污染：取下保護(hù)柱再進(jìn)行分析,如果必要更換保護(hù)柱。如果分析柱阻塞,拆下來清洗。如果問題仍然存在,可能是柱子被強(qiáng)保留物質(zhì)污染,運(yùn)用適當(dāng)?shù)脑偕胧?。如果問題仍然存在,入口可能被阻塞,更換篩板或更換色譜柱。②樣品溶劑不溶于流動相改變樣品溶劑,如果可能采取流動相作為樣品溶劑。

　　12.峰變形

　　樣品過載，減少樣品載量。

　　13.早出的峰變形

　　樣品溶劑選擇不恰當(dāng) ①減少進(jìn)樣體積 ②運(yùn)用低極性樣品溶劑

　　14.早出的峰拖尾程度大于晚出的峰

　　柱外效應(yīng) ①調(diào)整系統(tǒng)連接(使用更短、內(nèi)徑更小的管路) ②使用小體積的流通池

　　15.酸性或堿性化合物的峰拖尾

　　緩沖不合適①使用濃度50～100 mM的緩沖液②使用Pka等于流動相pH值的緩沖液

　　16.額外的峰

　　(1)樣品中有其他組分：正?，F(xiàn)象;

　　(2)前一次進(jìn)樣的洗脫峰：①增加運(yùn)行時(shí)間或梯度斜率②提高流速;

　　(3)空位或鬼峰：①檢查流動相是否純凈 ②使用流動相作為樣品溶劑 ③減少進(jìn)樣體積。

異常峰分析

異常的色譜峰指的是色譜圖中的無峰或出現(xiàn)負(fù)峰、寬峰、雙峰、肩峰、峰形不對稱等情況。異常峰是色譜實(shí)驗(yàn)工作中最棘手的問題。這些峰嚴(yán)重影響色譜分析的結(jié)果。色譜圖中不可能有純正的高斯對稱峰 , 輕微的拖尾是正常的 , 這是由分離系統(tǒng)所決定的。在此僅對幾種異常峰進(jìn)行分析。

1.峰前或峰后有小峰的分析

產(chǎn)生原因大致分為以下幾種情形

(1) 樣品不純?？筛淖儾煌牧鲃酉嗪蜕V柱 ,對樣品進(jìn)行分離比較 , 選擇合適的分離條件。

(2) 分析柱或保護(hù)柱柱頭塌陷。此情況較常見 ,可更換分析柱或保護(hù)柱后對峰形進(jìn)行比較。柱頭塌陷時(shí)往往所有的峰都會出現(xiàn)峰分裂 。對色譜柱再生和清洗可以改善分離效果。

(3) 色譜柱柱容量下降。當(dāng)長時(shí)間使用后 , 有一些強(qiáng)保留組分吸附在柱子中 , 不大的進(jìn)樣量往往就會出現(xiàn)峰分裂。用強(qiáng)洗脫能力的溶劑清洗色譜柱 , 或更換色譜柱可使問題得到改善。

(4) 樣品溶劑與流動相不匹配或進(jìn)樣體積過大。當(dāng)樣品溶劑比流動相極性大時(shí) , 有時(shí)即使進(jìn)樣體積很小 , 也容易出現(xiàn)峰變形和裂分現(xiàn)象。建議用流動相溶解樣品。

(5) 流動相不恰當(dāng)。此情況較罕見 , 有些樣品在特定的色譜條件下可能存在結(jié)構(gòu)的動態(tài)平衡 , 而出雙峰 , 這種雙峰是無法分離完全的 , 改變色譜條件尤其是p H 值會使峰形正常。

(6) 樣品分解。不穩(wěn)定的樣品在色譜分離過程中變成其他物質(zhì)而出現(xiàn)雙峰。這時(shí)需改變樣品處理方法或色譜分離條件。

2.負(fù)峰分析

在色譜分析中有時(shí)會出現(xiàn)負(fù)峰或倒峰 , 如圖 3 中的大峰的左下就有一負(fù)峰。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由以下幾種原因引起的 , 可針對不同情況進(jìn)行排除 , 進(jìn)而使問題得到解決。

(1) 流動相吸收本底值過高。此時(shí)可適當(dāng)改變檢測波長。

(2) 進(jìn)樣過程中進(jìn)入空氣。進(jìn)行排氣處理 , 直到基線平穩(wěn)再進(jìn)樣。

(3) 樣品組分的吸收低于流動相?？筛淖兞鲃酉嗷蚋淖儥z測波長。

(4) 配制樣品的溶液與流動相不一樣。重新配制樣品 , 用與流動相一樣的溶劑配制或稀釋樣品。

3.前沿、拖尾峰分析

拖尾：1 干擾峰，優(yōu)化條件分離 ；2 色譜柱塌陷，更換色譜柱； 3 流動相pH不合適，調(diào)節(jié)pH值 ；4 管路沒有接好，存在較大的死體積，可以重新接一下。

前沿：1 溶劑選擇不合適，選擇合適的溶劑 ；2 樣品過載，降低進(jìn)樣量； 3 柱溫太低，升高柱溫 ；4 色譜柱損壞，更換色譜柱 ；

圖譜前沿和拖尾的原因主要是流動相選擇不合適，可以相應(yīng)調(diào)整流動相的極性，或者適當(dāng)加入酸來調(diào)整，可以得到較好的改善。一般來講，酸堿在流動相中對于前沿和拖尾影響較大。 柱前沿是可能因?yàn)橹d，拖尾是可能因?yàn)闃悠繁晃廴?，選擇合適的流動相，調(diào)節(jié)好PH能夠改善這以情況。

前輩們總是會告訴我們，拖尾峰與柱子有關(guān)，可能是過載，稀釋樣品再做，或換新柱做。 有時(shí)候托尾峰往往是有機(jī)性相近雜質(zhì)沒有分開，此時(shí)，可以優(yōu)化分析方法，或更換柱子試一試；也可能由于柱子使用時(shí)間太久柱效下降出現(xiàn)塌陷等原因；再有也會根樣品本身性質(zhì)有關(guān)，基團(tuán)需要流動相中添加能與之結(jié)合優(yōu)化峰形的化學(xué)物質(zhì)，要根據(jù)具體情況而定。

4.色譜雙峰產(chǎn)生的可能及判斷和處理

液相上有一句經(jīng)典的話說得好 “出兩個(gè)峰肯定不是一種物質(zhì)，出一個(gè)峰不一定是一種物質(zhì)”。

而色譜雙峰指的是明是一種物質(zhì)，但在色譜圖中出現(xiàn)雙峰，而表明含二種物質(zhì)。我將這種情況分為四種原因。

1）色譜柱

如果你分析樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)每個(gè)色譜峰都雙峰出現(xiàn)（出峰越快，雙峰的可能性會減少），尤其采用單一純物質(zhì)時(shí)，可以肯定色譜柱出問題－柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。如果進(jìn)樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應(yīng)是柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行了。當(dāng)然不反沖，正沖有時(shí)也會正常的。如果峰拖尾，雙峰強(qiáng)弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，高頻紅外碳硫分析儀這是可以將進(jìn)樣那頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術(shù)，同時(shí)不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會應(yīng)柱效很低而報(bào)廢。

2）溶劑極性及進(jìn)樣量

許多HPLC分析者對此可能不以為然，一般的HPLC的書籍和文獻(xiàn)都不會提到這方面的內(nèi)容，而這確是雙峰產(chǎn)生的一個(gè)很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動相溶解，但是很多情況是不一致的。當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進(jìn)樣量大，如定量管為20ul，此條件下完全可以肯定，單一的純物質(zhì)出雙峰，第二峰比第一峰?。看味疾惶粯樱?，且拖尾，保留時(shí)間會提前（相對進(jìn)樣量少而言），將進(jìn)樣量減少一半以上，峰型將變?yōu)檎?。這是樣品的溶劑與流動相極性相差太大，而流動相來不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的。上面提到進(jìn)樣量造成雙峰的一個(gè)原因，另一個(gè)原因是，進(jìn)樣量不一定大，但絕對量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了，這是由于進(jìn)樣量過大，色譜柱過載造成的。

3）樣品的特性

有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，而這種互變異構(gòu)體無法分開，而是以一個(gè)動態(tài)平衡存在。在色譜分析時(shí)，在一個(gè)特定的條件下，一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現(xiàn)象將消失，如紅霉素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC－MS下，用質(zhì)譜檢測器，其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯，例如我分析過的農(nóng)藥啶蟲瞇（吡蟲清）。

4）參數(shù)

記錄的參數(shù)一般都內(nèi)定的，不必修改，但GC和HPLC的參數(shù)是不完全一致的，例如C－R3A數(shù)據(jù)記錄儀上的一般記錄時(shí)間間隔GC為2ms，HPLC 為5ms，如果記錄間隔時(shí)間縮短，一個(gè)峰將變?yōu)槎€(gè)峰或更多。

5.鬼峰、倒峰、未出峰

6.峰裂分

裂峰產(chǎn)生原因的確定

? 樣品基質(zhì)復(fù)雜或分析多種樣品——柱污染或部分阻塞濾片

? 流動相 pH>=7——由于硅膠溶解導(dǎo)致柱塌陷(除非使用專門的柱子)

? 溶劑比流動相的強(qiáng)度大——可能產(chǎn)生裂峰或?qū)挿澹蓸悠妨繘Q定 （溶劑化效應(yīng)）

7.峰拖尾、峰展寬、峰前伸

峰拖尾原因的確定

? 評價(jià)柱選擇——使用高純度硅膠柱或不同鍵合技術(shù)柱

? 評價(jià)流動相效果——改變流動相pH和添加劑消除次級效應(yīng)(流動相中組份與柱子相互作用)

? 減小進(jìn)樣量

? 消除柱外效應(yīng)

? 沖洗柱子——檢查柱子老化/塌陷