背景

膠質(zhì)母細胞瘤（Glioblastoma, GB）作為公認的中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性原發(fā)腫瘤，因其侵襲性生長方式及惡性程度極深，無法輕易與附近正常腦組織完全分離，往往導(dǎo)致其在短時間內(nèi)復(fù)發(fā)。因此，進一步研究膠質(zhì)母細胞瘤侵襲性生長的分子機制是十分必要且迫切的。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白如CDH1、CDH2和MMPs，或者血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry, VM）過程，可以調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細胞瘤的遷移和侵襲能力，影響腫瘤發(fā)展過程。許多研究者認為對膠質(zhì)母細胞瘤的EMT和VM過程進行更深入的研究可能為新的治療膠質(zhì)母細胞瘤提供線索。

N6-甲基腺嘌呤(m6A)修飾被認為是真核mRNA中最豐富的修飾，在哺乳動物細胞中起重要作用，該過程由三類蛋白靈活動態(tài)地調(diào)控：“編碼器writer”（類甲基轉(zhuǎn)移酶3 (METTL3)、METTL14和Wilms腫瘤1-相關(guān)蛋白(WTAP)）、“消碼器eraser”（脂肪質(zhì)量和肥胖相關(guān)蛋白(FTO)和AlkB同源蛋白5 (ALKBH5)）和“讀碼器reader”（YT521-B同源(YTH)結(jié)構(gòu)域包含家族蛋白(YTHDF1/2/3)、YTHDC1/2）。大量證據(jù)表明，膠質(zhì)母細胞瘤中m6A水平可影響腫瘤的增殖、放射抗拒和侵襲。然而，目前對RNA m6A修飾在膠質(zhì)母細胞瘤EMT和VM過程中的作用關(guān)注較少。

為了研究RNA m6A修飾在膠質(zhì)母細胞瘤EMT和VM過程中的作用，來自中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院神經(jīng)科的Min Tao等研究人員在American Journal of Cancer Research雜志上發(fā)表一篇名為“Decreased RNA m6A methylation enhances the process of the epithelial mesenchymal transition and vasculogenic mimicry in glioblastoma”的文章。該文章報道了他們通過構(gòu)建METTL3敲低和ALKBH5過表達細胞系模型并結(jié)合體外的CCK-8、EdU檢測、FCM分析、創(chuàng)傷愈合實驗、transwell實驗、Phalloidin染色等實驗評估了RNA m6A修飾膠質(zhì)母細胞瘤中EMT和VM的生物學(xué)作用；最后進一步構(gòu)建了U87-GFP-Luc/U87-ALKBH5-Luc小鼠原位模型探討ALKBH5在體內(nèi)對膠質(zhì)母細胞瘤的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RNA m6A甲基化抑制了膠質(zhì)母細胞瘤中EMT和VM的過程，為尋找GB的潛在治療靶點提供了新的視角。

源井生物在該研究中提供了用于構(gòu)建ALKBH5過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株的慢病毒，以助力科研人員在ALKBH5穩(wěn)定表達背景的細胞水平上研究m6A修飾對膠質(zhì)母細胞瘤的影響，為其驗證過程打下堅實基礎(chǔ)。對于構(gòu)建常用慢病毒法轉(zhuǎn)染的細胞模型，源井不僅擁有成熟的慢病毒第三代包裝系統(tǒng)，更是在上千例真實項目中積累出獨家細胞轉(zhuǎn)染體系數(shù)據(jù)庫，覆蓋超200種細胞，能提供優(yōu)質(zhì)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建服務(wù)，并滿足客戶挑取單克隆的需求，歡迎前往官網(wǎng)了解詳情>>https://www.ubigene.com/service/cell/overexpression.html

ALKBH5可促進GB細胞增殖，影響細胞周期

在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)，在GB細胞和膠質(zhì)瘤組織中，m6A?RNA水平降低。ALKBH5mRNA高表達的患者獲得的中位總生存時間(OS)相對較短，而MEETL3相對高表達的患者延長了無病生存期。作者還對ALKBH5在GB中的功能作用進行了深入研究，其中CCK-8實驗表明，上調(diào)ALKBH5可以增強體外細胞活力(圖1A)。同樣，EdU檢測也表明，與對照組相比，過表達ALKBH5明顯提高了細胞的增殖能力(圖1B,C)。另外，通過FCM實驗，作者測量了細胞凋亡率和細胞周期分布。他們發(fā)現(xiàn)與對照組細胞相比，過表達U87-MG ALKBH5的細胞可以加速細胞周期的S期和G2/M期，并伴隨6%的減少率(圖1F, G)。這表明了在U87-MG細胞中，ALKBH5可能通過影響細胞周期而不是改變細胞凋亡來促進GB增殖。

RNA?m6A水平在GB細胞中調(diào)控EMT和VM過程

為了研究U87-MG細胞中RNA m6A甲基化在EMT過程中的作用，作者通過創(chuàng)傷愈合實驗和transwell發(fā)現(xiàn)，過表達ALKBH5或敲低METTL3都可以促進U87-MG細胞的遷移和侵襲能力(圖2B-E)。Phalloidin染色顯示，過表達ALKBH5可以通過一種主要微纖維蛋白F-actin的重排，導(dǎo)致細胞骨架更加分散(圖2F)。在過表達ALKBH5或敲低METTL3的U87-MG細胞中，F(xiàn)N1、MMP2和CDH2蛋白表達均上調(diào)，而CDH1蛋白表達下調(diào)(圖2G,?2H)。這些數(shù)據(jù)表明，RNA m6A甲基化可能對膠質(zhì)母細胞瘤細胞的EMT過程產(chǎn)生重要影響。

此外，為了評估U87-MG細胞中RNA m6A甲基化水平對VM的影響，作者進行了三維培養(yǎng)。過表達ALKBH5增強了U87-MG細胞形成VM的能力(圖3A)。同樣，在U87-MG細胞中，敲低METTL3也可以上調(diào)VM形成的能力(圖3B)。

總而言之，RNA m6A甲基化水平的降低可促進膠質(zhì)母細胞瘤的EMT和VM過程。上調(diào)ALKBH5或下調(diào)METTL3可通過調(diào)控CDH1、CDH2、MMP2和FN1的表達增強膠質(zhì)母細胞瘤的侵襲性。這個研究強調(diào)了RNA m6A修飾在不同類型癌癥中的不同作用，進一步為GB的治療提供了新的見解。

過表達或敲低某一基因來研究其下游基因的表達調(diào)控作用是一種常見的研究套路，源井可提供優(yōu)質(zhì)的過表達/干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建服務(wù)和慢病毒/腺相關(guān)病毒/腺病毒包裝服務(wù)，穩(wěn)定表達的細胞不僅能有助于表型實驗的開展，還能避免重復(fù)實驗的數(shù)據(jù)中較大的誤差，助推實驗順利開展。源井專注于基因編輯領(lǐng)域，擁有數(shù)百種細胞培養(yǎng)和編輯經(jīng)驗，多篇文獻引用報道。可前往我們官網(wǎng)了解更多>>https://www.ubigene.com/