都說(shuō)科研難、科研苦，等結(jié)果的過(guò)程堪比漫漫取經(jīng)路。不過(guò)，要學(xué)會(huì)換個(gè)角度、換個(gè)方向重新看問(wèn)題就會(huì)柳暗花明又一村。 相信單細(xì)胞測(cè)序大家都早有耳聞，近幾年熱度持續(xù)上升。那會(huì)不會(huì)已經(jīng)沒(méi)什么可以創(chuàng)新的思路了呢？當(dāng)然不是，只要你在PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，就會(huì)發(fā)現(xiàn)，依據(jù)單細(xì)胞測(cè)序可以有大量不同的新穎的角度。不僅要測(cè)序，后續(xù)的分析更加重要。即通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，對(duì)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)進(jìn)行分析。其目的是揭示生物體內(nèi)基因表達(dá)的差異性，進(jìn)而了解細(xì)胞命名的遺傳調(diào)控過(guò)程，在細(xì)胞水平內(nèi)全面控制分子機(jī)理，實(shí)現(xiàn)自發(fā)發(fā)育、差異發(fā)育、性狀表達(dá)和適應(yīng)環(huán)境等生命特征和特性。目前被廣泛運(yùn)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。例如對(duì)于癌細(xì)胞，細(xì)胞種群相互之間的異質(zhì)性及其在癌癥內(nèi)部隨時(shí)間和治療進(jìn)展而發(fā)展的進(jìn)化對(duì)于洽療方案的制定和影響是至關(guān)重要的。 小云苦苦尋找了一篇典范就趕緊和大家一起分享了。這篇文章通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞亞群分類(lèi)鑒定，然后通過(guò)一系列GO富集分析、細(xì)胞間通訊分析、生存分析以及可視化分析和統(tǒng)計(jì)分析T細(xì)胞B細(xì)胞串?dāng)_所促進(jìn)的獨(dú)特免疫特征，建立了一種能夠有效預(yù)測(cè)癌癥患者預(yù)后狀態(tài)的預(yù)后標(biāo)志。這為癌癥提供了更好的預(yù)后信息和有效的治療靶點(diǎn)。具體的分析過(guò)程快和小云一起往下學(xué)習(xí)吧！

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題目：?jiǎn)渭?xì)胞圖譜揭示了三陰性乳腺癌中T細(xì)胞-B細(xì)胞交叉作用的獨(dú)特免疫譜

雜志：Cancer Communications

影響因子：IF=16.2

發(fā)表時(shí)間：2023年6月

研究背景

免疫療法正在成為實(shí)體瘤中有希望的治療選擇。由于免疫治療的抗腫瘤作用與腫瘤免疫微環(huán)境（TME）密切相關(guān)，因此解剖復(fù)雜且異質(zhì)的TME是找到合適的治療靶點(diǎn)和提高免疫治療的臨床療效的基礎(chǔ)。表征每種腫瘤獨(dú)特的免疫微環(huán)境對(duì)于更好地預(yù)測(cè)預(yù)后和指導(dǎo)癌癥免疫治療具有重要意義。然而，與乳腺癌的其他亞型相比，三陰性乳腺癌（TNBC）的免疫微環(huán)境的獨(dú)特特征仍然難以捉摸。因此，作者旨在描述和比較TNBC、人表皮生長(zhǎng)因子受體2陽(yáng)性（HER2+）乳腺癌和管腔樣乳腺癌之間的免疫景觀(guān)。

數(shù)據(jù)來(lái)源

研究思路

對(duì)從人正常乳腺組織和各種亞型的原發(fā)性乳腺腫瘤中分離的CD 45+免疫細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)。通過(guò)分析scRNA-seq數(shù)據(jù)，鑒定了免疫細(xì)胞簇，并在TNBC、人HER 2+乳腺癌和管腔樣乳腺癌之間比較了它們的比例以及轉(zhuǎn)錄組特征。還進(jìn)行了假時(shí)間和細(xì)胞-細(xì)胞通訊分析以表征免疫微環(huán)境。

研究結(jié)果

1.乳腺癌免疫細(xì)胞的群體特征和單細(xì)胞譜分析

將診斷為浸潤(rùn)性導(dǎo)管乳腺癌并經(jīng)歷乳房切除術(shù)的一組女性患者（n = 17）納入本研究（圖1A）。在40%的患者中確定了淋巴結(jié)陽(yáng)性，60%的患者被分類(lèi)為組織學(xué)III級(jí)。對(duì)于分子亞型，在該隊(duì)列中有4名患者患有TNBC，6名患有HER 2

+

，7名患有管腔樣乳腺癌。為了闡明具有不同分子亞型的乳腺癌的免疫景觀(guān)，對(duì)通過(guò)FACS從該組中的一組21個(gè)新鮮切除的乳腺組織樣品分離的CD45+免疫細(xì)胞進(jìn)行scRNAseq：4例正常乳腺組織、4例TNBC、6例HER2+和7例管腔樣乳腺癌（圖1A）。獲得了這些免疫細(xì)胞的總計(jì)117958個(gè)高質(zhì)量的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。 如圖1B所示，當(dāng)將細(xì)胞投影到2D UMAP圖中時(shí)，通過(guò)檢查典型標(biāo)志物基因來(lái)區(qū)分4個(gè)主要免疫細(xì)胞簇，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和骨髓細(xì)胞（圖1C）。通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)，將這4個(gè)細(xì)胞群進(jìn)一步劃分為31個(gè)免疫細(xì)胞亞群：11個(gè)T細(xì)胞簇、6個(gè)B細(xì)胞簇、6個(gè)NK細(xì)胞簇和8個(gè)骨髓細(xì)胞簇（圖1D）。 為了揭示乳腺癌中免疫細(xì)胞圖譜的異質(zhì)性，比較了乳腺癌和正常組織的不同亞型中主要細(xì)胞群和亞群的比例。值得注意的是，B細(xì)胞主要在TNBC、HER 2

+

和管腔樣乳腺癌中富集，但在正常組織中很少，平均比例分別為10.1%、12.3%和7.6%，而0.9%（圖1E）。對(duì)獨(dú)立的腫瘤和正常樣品進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)以驗(yàn)證scRNA-seq的發(fā)現(xiàn)。類(lèi)似地，與TNBC、HER 2

+

和管腔樣乳腺癌組織中的B細(xì)胞相比，正常組織中存在較少的B細(xì)胞（圖1F）。關(guān)于亞群，發(fā)現(xiàn)較低水平的GZMB

+

細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞，但發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，腫瘤中較高水平的F0XP3

+

Treg，表明乳腺癌中的抑制性TME（圖1E）。這些發(fā)現(xiàn)也通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)，其顯示與腫瘤組織相比，正常組織中細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞的比例顯著增加，而Treg的比例顯著降低（圖1F）。

圖1不同亞型乳腺癌和正常組織中的免疫細(xì)胞景觀(guān)

2.?TNBC中T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制環(huán)境

在此鑒定了T細(xì)胞構(gòu)成乳腺癌中最大的浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞簇。在將93115個(gè)T細(xì)胞重新聚類(lèi)后，基于其特征基因鑒定了總共11個(gè)T細(xì)胞簇，包括CD 4+區(qū)室中的6個(gè)簇和CD 8+區(qū)室中的5個(gè)簇（圖2A-C）。值得注意的是，T細(xì)胞簇的分布模式在乳腺癌的各種分子亞型中是異質(zhì)的（圖2D）。與HER2

+

和管腔樣乳腺癌相比，在TNBC中發(fā)現(xiàn)Treg和耗盡的CD8+ T細(xì)胞水平增加，表明免疫抑制環(huán)境。在外部scRNA-seq數(shù)據(jù)集中也驗(yàn)證了TNBC中Treg和耗盡的CD 8+T細(xì)胞的較高浸潤(rùn)水平。 Treg的轉(zhuǎn)錄組分析表明，與HER2+和管腔樣乳腺癌中的那些相比，LGALS9、TNFRSF4、CD27和CD28的共刺激基因以及IL2RA、IL2RB、IL2RG、ENTPD1和LAG3的免疫抑制相關(guān)基因在TNBC中富集，表明TNBC中的Treg具有更顯著的免疫抑制功能（圖2E）。類(lèi)似地，與HER2

+

和管腔樣乳腺癌相比，TNBC中耗竭的CD8+ T細(xì)胞和細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞表達(dá)更高水平的功能失調(diào)標(biāo)簽基因以及與耗竭相關(guān)的TF。這表明TNBC中CD8+ T細(xì)胞的耗竭程度更高（圖2E）。與基因表達(dá)分析的結(jié)果一致，TNBC中T細(xì)胞的獨(dú)特免疫抑制特征也通過(guò)Treg的顯著更高的免疫抑制特征評(píng)分和耗盡的CD8+ T細(xì)胞和細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞的更高的功能失調(diào)特征評(píng)分來(lái)反映（圖2F）。

圖 2乳腺癌和正常組織中不同分子亞型T細(xì)胞的組成和功能

3.?TNBC中漿細(xì)胞的富集

作為在腫瘤和正常組織之間的比例方面具有最顯著差異的細(xì)胞群，將B細(xì)胞進(jìn)一步分成6個(gè)亞群，每個(gè)亞群具有其獨(dú)特的標(biāo)簽基因（圖3A-D）。當(dāng)比較不同分子亞型中每個(gè)B細(xì)胞簇的比例時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)TNBC表現(xiàn)出比HER 2+和管腔樣乳腺癌顯著更高水平的漿細(xì)胞（B_c05_Plasma_IGHG1）（分別為48.2%、1.5%和4.0%;圖3E），這通過(guò)scRNA-seq數(shù)據(jù)集和流式細(xì)胞術(shù)分析（圖3F）中的外部驗(yàn)證進(jìn)一步證實(shí)。 為了確定B細(xì)胞簇的分化軌跡，進(jìn)行偽時(shí)間分析。B細(xì)胞的假時(shí)間軌跡保留了兩種分化途徑（圖4A），從初始B細(xì)胞開(kāi)始，并且主要以記憶B細(xì)胞在一端結(jié)束，或漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞在另一端結(jié)束（圖4B）。雖然屬于相同簇的細(xì)胞可以分布到不同的分化途徑中，但分析顯示根據(jù)偽時(shí)間順序，從幼稚B細(xì)胞到記憶B細(xì)胞到最終以漿母細(xì)胞和漿細(xì)胞結(jié)束的連續(xù)過(guò)渡過(guò)程（圖4C）。圖4C中還顯示了沿著該轉(zhuǎn)變過(guò)程的差異表達(dá)的TF，如

BCL6

、

IRF4

和

E2F5

，并且可能是分化過(guò)程中的關(guān)鍵參與者。 根據(jù)在軌跡分支中的位置，將B細(xì)胞分成三組，稱(chēng)為預(yù)分支、路徑I和路徑II（圖4D）。幾乎所有的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞被歸類(lèi)為路徑II，比例分別為95.2%和92.0%。有趣的是，在乳腺癌的所有亞型中均存在雙途徑分化模式，但分化模式不同（圖4D）。TNBC中的B細(xì)胞傾向于從預(yù)分支分化到路徑II，其中82.7%的B細(xì)胞分布在路徑II中，并且4.4%的B細(xì)胞分布在路徑I中。相比之下，HER2

+

和管腔樣乳腺癌中的B細(xì)胞更可能從分支前分化為路徑I而不是路徑II，分別只有8.1%和11.5%的B細(xì)胞位于路徑II中（圖4D）。 鑒定了預(yù)分支、路徑I和路徑II的標(biāo)簽基因和富集的GO途徑(圖4E)。沿著兩個(gè)不同的軌跡路徑也觀(guān)察到不同的基因表達(dá)模式(圖4F)。沿著B(niǎo)細(xì)胞從預(yù)分支到路徑I的細(xì)胞軌跡，與T細(xì)胞分化和白細(xì)胞細(xì)胞-細(xì)胞粘附相關(guān)的基因的表達(dá)水平逐漸升高(圖4F)。另一方面，沿著B(niǎo)細(xì)胞從預(yù)分支到路徑II的細(xì)胞軌跡，觀(guān)察到富集B細(xì)胞活化、免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和Fcγ受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑的基因的表達(dá)增加（圖4F）。

圖 4假時(shí)間分析定義了乳腺癌不同分子亞型中B細(xì)胞的兩種分化模式

4.?TNBC中明顯的T細(xì)胞-B細(xì)胞串?dāng)_

為了確定驅(qū)動(dòng)TNBC中上述不同T和B細(xì)胞浸潤(rùn)模式的潛在機(jī)制，研究了11個(gè)T細(xì)胞簇和6個(gè)B細(xì)胞簇中配體-受體對(duì)的表達(dá)水平以預(yù)測(cè)T細(xì)胞-B細(xì)胞相互作用。共分析了229個(gè)功能相關(guān)的信號(hào)通路，包括2021個(gè)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的分子相互作用。結(jié)果顯示，26種信號(hào)傳導(dǎo)途徑在T細(xì)胞-B細(xì)胞串?dāng)_中有活性，但這些信號(hào)傳導(dǎo)途徑的組成和相對(duì)強(qiáng)度因分子亞型而異。具體而言，CD86和CD39信號(hào)通路在TNBC中特異性地活躍，而CXCL信號(hào)通路主要來(lái)源于HER2+乳腺癌。然后系統(tǒng)地研究和篩選在TNBC中顯著更突出的途徑，其中基于29個(gè)配體-受體對(duì)的T細(xì)胞-B細(xì)胞相互作用大多在記憶B細(xì)胞之間富集，漿母細(xì)胞在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包括CD8+T細(xì)胞、CTLA 4+Tfh、Treg和耗竭的CD 8 + T細(xì)胞（圖5A）。 通過(guò)評(píng)估與免疫調(diào)節(jié)功能相互作用的通訊概率（圖5B）和配體-受體對(duì)表達(dá)水平（圖5C-D），最終在5個(gè)簇中鑒定了7種富含TNBC的T細(xì)胞-B細(xì)胞相互作用，其可以促進(jìn)TNBC中的不同TIME，其在索狀圖中突出顯示。在本研究中，還預(yù)測(cè)漿母細(xì)胞（B_c06_PB_MKI67）經(jīng)由

LGALS9-HAVCR2

對(duì)在TNBC中與耗盡的CD 8 + T細(xì)胞相互作用(圖5B-C)。這種相互作用可能導(dǎo)致耗盡的T細(xì)胞的水平增加。此外，在作者的分析中鑒定的TNBC中的強(qiáng)CD27-CD70相互作用可以促進(jìn)T細(xì)胞耗竭(圖5B-C)。此外，先前已經(jīng)報(bào)道，CD 39可以將細(xì)胞外ATP轉(zhuǎn)化為細(xì)胞外腺苷（ADO），其可以聯(lián)合收割機(jī)其受體

AD0RA2A

來(lái)啟動(dòng)免疫抑制性TME。作為T(mén)NBC中的排他性信號(hào)傳導(dǎo)途徑，CD 39信號(hào)傳導(dǎo)途徑使得記憶B細(xì)胞能夠經(jīng)由

ENTPDl(CD39)-ADORA2A

對(duì)與耗盡的CD 8+T細(xì)胞通信，這也可以促進(jìn)TNBC中的免疫抑制(圖5B-C)。這里，TNBC中的記憶B細(xì)胞高度表達(dá)

IC0SLG

和

CXCR5

，而TNBC中的Tfh細(xì)胞高度表達(dá)

IC0S

和

CXCL13

(圖5D)。 總之，基于

IL16-CD4

、

LGALS9-HAVCR2

、

CD27-CD70

、

ICOSLG-CTLA 4

、

CD 86-CTLA 4

和

ENTPD 1

(CD 39)-

ADORA2A

對(duì)的TNBC中的特異性T細(xì)胞-B細(xì)胞串?dāng)_歸因于免疫抑制性TIME，而突出的

ICOSLG-ICOS

和

CXCL13-CXCR5

相互作用幫助TIME建立B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞的有利環(huán)境（圖5E）。

圖5細(xì)胞-細(xì)胞通訊分析表明TNBC中獨(dú)特的T細(xì)胞-B細(xì)胞相互作用

5.?TNBC中基于T細(xì)胞-B細(xì)胞串?dāng)_的預(yù)測(cè)簽名

由于該研究的結(jié)果表明T細(xì)胞-B細(xì)胞串?dāng)_可能有助于形成TNBC中的不同TIME，因此假設(shè)T細(xì)胞-B細(xì)胞串?dāng)_中涉及的相關(guān)基因和細(xì)胞簇可能為T(mén)NBC患者提供重要的預(yù)后信息。因此，基于TNBC中的T細(xì)胞-B細(xì)胞串?dāng)_產(chǎn)生預(yù)后特征。 首先，評(píng)估METABRIC數(shù)據(jù)集中涉及的基因和細(xì)胞簇的預(yù)后價(jià)值，其中使用基于DEG的單細(xì)胞衍生的基因標(biāo)記來(lái)估計(jì)不同細(xì)胞簇的浸潤(rùn)水平。結(jié)果表明，

CTLA4

、

ICOS

、

CXCL13

、CD4_c05-Tfh_CTLA4、CD4_c06_Treg_F0XP3、CD8_c10_exhauted_HAVCR2和B_C04_memory_ZBTB32與TNBC患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期（RFS）和總生存期（OS）顯著相關(guān)(圖6A)。其次，根據(jù)基于上述七個(gè)預(yù)測(cè)因子的多變量考克斯回歸分析，用三個(gè)選擇的預(yù)測(cè)因子，即CTLA4、CD4_c06_Treg_CTLA4和B_c04_memory_ZBTB32構(gòu)建TBCS。之后，將高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間的預(yù)后除以METABRIC數(shù)據(jù)集和外部驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中TNBC患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分進(jìn)行比較，以驗(yàn)證TBCS的預(yù)后值(圖6B)。高風(fēng)險(xiǎn)組患者在METABRIC數(shù)據(jù)集中的RFS和OS顯著更差，在外部驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中的RFS更差(圖6C)。在校正年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)和腫瘤分級(jí)后(圖6D)，在兩個(gè)RFS方面，高風(fēng)險(xiǎn)組中TNBC患者的預(yù)后比低風(fēng)險(xiǎn)組差。然而，TBCS未能預(yù)測(cè)患有HER2+乳腺癌（P > 0.05）或管腔樣乳腺癌（P > 0.05）的患者的預(yù)后，表明TBCS的獨(dú)特預(yù)后價(jià)值對(duì)于患有TNBC的患者是特別有益的。

圖6基于TNBC中獨(dú)特的T細(xì)胞-B細(xì)胞相互作用的預(yù)后特征的構(gòu)建

6.?TNBC中細(xì)胞毒性NK細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞的富集

除T、B細(xì)胞外，NK細(xì)胞和髓系細(xì)胞在TNBC中的分布模式也與其他分子亞型的乳腺癌不同。將總共10676個(gè)NK細(xì)胞重新聚集成6個(gè)亞組，包括4個(gè)NK簇和2個(gè)NKT簇（圖7A-D）。有趣的是，類(lèi)似于正常組織，TNBC表現(xiàn)出相當(dāng)高水平的細(xì)胞毒性NK細(xì)胞，但低水平的耗竭NK細(xì)胞，代表NK活性抗腫瘤環(huán)境。相比之下，HER2+和管腔樣乳腺癌富含耗盡的NK細(xì)胞，但具有很少的細(xì)胞毒性NK細(xì)胞，表明它們的NK耗盡的前腫瘤環(huán)境(圖7E)。這種不同的NK細(xì)胞浸潤(rùn)模式表明，TNBC患者由于基線(xiàn)時(shí)細(xì)胞毒性NK細(xì)胞水平相對(duì)較高，可能無(wú)法從NK靶向治療中獲益，這可能限制了藥物進(jìn)一步加強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤作用的能力。然而，基于NK的免疫療法被建議用于開(kāi)發(fā)HER2+和管腔樣乳腺癌的合適治療，因?yàn)樗鼈兊腘K耗盡的微環(huán)境。

圖 7與TNBC相比，HER2+和管腔樣BC在NK細(xì)胞浸潤(rùn)中顯示出不同的特征

研究結(jié)論

本研究通過(guò)單細(xì)胞譜分析，全面表征了TNBC與HER2+、管腔樣乳腺癌和正常乳腺組織的不同免疫景觀(guān)。TNBC具有獨(dú)特的TIME，其特征在于T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制和大量漿細(xì)胞，可能由T細(xì)胞B細(xì)胞相互作用形成。建立TBCS來(lái)預(yù)測(cè)TNBC患者的預(yù)后。此外，本研究的發(fā)現(xiàn)提供了洞察未來(lái)免疫治療策略的潛在靶點(diǎn)不同分子亞型的乳腺癌。 文章小結(jié)

通過(guò)這篇文章再次證明了解TIME對(duì)改善疾病預(yù)后和指導(dǎo)免疫治療具有重要意義。在該研究中，發(fā)現(xiàn)TNBC具有明顯的免疫抑制TIME特征，通過(guò)Treg和耗盡的CD8+ T細(xì)胞的富集所反映的，并且其伴隨B細(xì)胞傾向于分化為漿細(xì)胞，這可能是由T細(xì)胞B細(xì)胞串?dāng)_驅(qū)動(dòng)的。進(jìn)一步生成TBCS用于TNBC預(yù)后的預(yù)測(cè)。本研究的結(jié)果不僅突出了乳腺癌各種分子亞型的不同特征，而且為基于NK的免疫治療提供了一個(gè)有希望的研究方向，以延緩HER2+和管腔樣乳腺癌的發(fā)展。文章選材新穎，論述詳盡，各類(lèi)分析均有涉及，體量較大。方法上有很多值得我們反復(fù)學(xué)習(xí)的地方。