寫(xiě)在前面

????????今天推薦的是由中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞與生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)在2019年4月1日發(fā)表于Nature Communications（IF：12.117，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊是Tongbiao Zhao教授，研究表明USP8與EPG5相互作用并介導(dǎo)其去泛素化，從而調(diào)節(jié)ESCs干性。

研究背景

????????自噬是真核細(xì)胞中一個(gè)高度保守的溶酶體介導(dǎo)的分解代謝過(guò)程?；A(chǔ)自噬可以去除錯(cuò)誤折疊或易聚集的蛋白和受損的細(xì)胞器，這在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。? ? ?

????????胚胎干細(xì)胞(ESCs)可以無(wú)限增殖，并保持分化為任何體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的潛能。研究發(fā)現(xiàn)ESCs保持較高的自噬通量，以確?？焖僭鲋澈妥晕腋隆４送?，基礎(chǔ)自噬已被證實(shí)可以降解小鼠ESCs中的線粒體，從而維持線粒體動(dòng)態(tài)平衡。研究表明，高自噬通量是ESC的內(nèi)在特征，并在ESC的自我更新和多能性中起關(guān)鍵作用，然而其中的潛在機(jī)制仍不清楚。

摘要部分

????????作者篩選了小鼠ESCs中促進(jìn)自噬的分子，并確定了EPG5。EPG5是一個(gè)真核特異性的自噬調(diào)節(jié)因子，其介導(dǎo)自噬小體/溶酶體融合。研究表明，EPG5在ESCs中高表達(dá)，并有助于維持ESC干性。作者還發(fā)現(xiàn)去泛素酶USP8與EPG5的Coiled-coil結(jié)構(gòu)域結(jié)合。機(jī)制上，USP8直接從EPG5的K252位去除非經(jīng)典的K63-泛素鏈，從而增強(qiáng)EPG5和LC3的相互作用。作者的這項(xiàng)工作揭示了泛素化和自噬之間新的交叉通路。

研究?jī)?nèi)容

1.EPG5對(duì)ESC的自我更新和多能性至關(guān)重要??? ?

????????作者通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選了體細(xì)胞和ESCs中一系列自噬調(diào)控基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EPG5在ESCs中高表達(dá)。通過(guò)定量PCR和WB檢測(cè)，作者證實(shí)了Epg5的mRNA和蛋白水平在ESCs中都有較高表達(dá)。? ? ?

????????作者敲除了小鼠ESCs中的Epg5。利用克隆形成實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)ESCs中Epg5的缺失顯著抑制了克隆形成效率，但不影響ESC凋亡和分化標(biāo)志基因的表達(dá)。

????????實(shí)驗(yàn)顯示，與EPG5+/+?ESCs相比，EPG5-/-?ESCs的多能性基因表達(dá)減少，這表明EPG5的缺失導(dǎo)致ESCs的多能性受損。此外，EPG5-/-?ESCs顯示出異常的胚體分化，其特征是某些中胚層標(biāo)記基因的延遲表達(dá)。

研究結(jié)論：EPG5在ESC的自我更新中起重要作用，同時(shí)EPG5還是ESC多能性的關(guān)鍵調(diào)控因子。

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2.EPG5的coiled-coil結(jié)構(gòu)域調(diào)控ESC特性??? ?

????????作者接下來(lái)探究EPG5是否調(diào)節(jié)自噬通量，高的自噬通量可以維持ESC的自我更新和多能性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EPG5的耗盡顯著降低了ESCs的自噬通量。通過(guò)生信分析，作者發(fā)現(xiàn)EPG5有一個(gè)coiled-coil結(jié)構(gòu)域，其可作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的識(shí)別系統(tǒng)。

????????作者制備了缺乏coiled-coil結(jié)構(gòu)域的EPG5突變體(ΔCCD)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在EPG5-/-?ESCs中表達(dá)WT Epg5，而不是ΔCCD Epg5突變體，可以恢復(fù)減少的自噬通量，并改善缺陷的自我更新和多能性。

研究結(jié)論：EPG5的coiled-coil結(jié)構(gòu)域?qū)τ诰S持ESC特性至關(guān)重要。

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3.EPG5直接與USP8相互作用? ?

????????作者合成了一種與小鼠EPG5的coiled-coil結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的多肽，并將其作為誘餌捕獲EPG5相互作用的蛋白。LC-MS/MS分析鑒定出一種去泛素酶USP8，其涉及線粒體質(zhì)量控制、核內(nèi)體運(yùn)輸和細(xì)胞增殖。

????????然后作者在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了Flag-EPG5和/或HA-USP8，co-IP結(jié)果顯示，USP8與EPG5免疫共沉淀。作者進(jìn)一步證實(shí)了EPG5和USP8在ESCs中的相互作用。作者還發(fā)現(xiàn)ESCs中內(nèi)源性的EPG5也能被USP8免疫沉淀。

研究結(jié)論：EPG5與USP8結(jié)合，并在ESCs中相互作用。

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4.ESC特性的調(diào)控需要USP8??? ?

????????WB顯示USP8在小鼠和人類(lèi)多能干細(xì)胞中均高表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)等位基因Usp8?/-中有13bp的缺失，而Usp8?/-?ESCs的USP8蛋白表達(dá)降低。實(shí)驗(yàn)顯示，與WT ESCs相比，Usp8?/-?ESCs形成的克隆數(shù)量明顯減少，而且Usp8?/-?ESCs中多能基因的表達(dá)減少。這些表明USP8對(duì)于ESC的自我更新和多能性至關(guān)重要。

????????研究發(fā)現(xiàn)，WT Usp8使Usp8?/-ESCs的集落形成能力得到恢復(fù)，而C748A突變體Usp8則未能恢復(fù)。類(lèi)似的，WT Usp8可恢復(fù)Usp8?/-?ESC系中多能基因的表達(dá)，但C748A突變體不能。

研究結(jié)論：USP8對(duì)于維持ESC特性至關(guān)重要。USP8依賴(lài)其去泛素酶活性來(lái)調(diào)節(jié)ESCs的自我更新和多能性。

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5.USP8通過(guò)去除K63-泛素鏈?zhǔn)笶PG5去泛素化? ? ?

????????作者發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Usp8使ESCs中EPG5的泛素修飾減少，而下調(diào)Usp8則增加了EPG5的泛素化。進(jìn)一步研究表明，過(guò)表達(dá)WT USP8可完全消除EPG5的泛素化，但C748A突變體USP8不能。? ? ?

????????實(shí)驗(yàn)顯示，在轉(zhuǎn)染EPg5和泛素的293T中，抗K63抗體能檢測(cè)到泛素化的EPG5，但抗K48抗體不能。而K63突變?yōu)镽63后極大地降低了EPG5的泛素化。此外，WT USP8有效去除了EPG5的K63-泛素化，但C748A突變體USP8不能。

????????接著作者利用LC-MS/MS分析確定了EPG5中的六種賴(lài)氨酸可能與泛素結(jié)合。共IP顯示，只有K252的突變消除了EPG5的泛素化。

研究結(jié)論：USP8直接去泛素化EPG5，USP8特異性去除EPG5上K252連接的K63-泛素鏈。

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6.USP8調(diào)控EPG5和LC3之間的相互作用

????????作者發(fā)現(xiàn)，Usp8?/-?ESC的自噬通量顯著降低，而過(guò)表達(dá)Usp8的ESCs自噬通量更高。這表明USP8在ESCs中保護(hù)自噬通量。

????????已知EPG5通過(guò)直接結(jié)合LC3介導(dǎo)自噬，作者接下來(lái)探究USP8對(duì)EPG5的去泛素化是否破壞EPG5與LC3的相互作用，并最終影響ESC干性。實(shí)驗(yàn)表明，Usp8的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了LC3和EPG5的相互作用。相反，抑制Usp8減少了LC3和EPG5的相互作用。

研究結(jié)論：USP8通過(guò)促進(jìn)EPG5與LC3的相互作用來(lái)保護(hù)自噬通量以維持ESC特性。

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結(jié)論與討論

????????本研究中作者定義了一種新的維持ESCs多能性的機(jī)制,并將ESCs的自噬和泛素化兩個(gè)分解代謝過(guò)程聯(lián)系起來(lái)。作者發(fā)現(xiàn)EPG5去泛素化USP8，這是ESCs自噬調(diào)控的基礎(chǔ)。研究表明,USP8通過(guò)直接去泛素化EPG5來(lái)鞏固EPG5與LC3的相互作用，從而維持ESC的正常自噬與干細(xì)胞特性。作者的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了對(duì)自噬和泛素介導(dǎo)的降解機(jī)制和功能的理解。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-09430-4

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