膀胱癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，預(yù)后較差，在中國(guó)泌尿系統(tǒng)中也較為常見(jiàn)。有研究表明，環(huán)狀RNA通過(guò)作為miRNA海綿參與膀胱癌的進(jìn)展，但是環(huán)狀RNA的潛在作用和分子機(jī)制有待進(jìn)一步的探索和研究。已有文獻(xiàn)表明Hippo通路在人類癌癥中的異常狀態(tài)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移進(jìn)展和代謝轉(zhuǎn)移。那么在膀胱癌發(fā)展過(guò)程中，環(huán)狀RNA是否與Hippo通路有關(guān)呢？

2023年9月10日，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科王非凡團(tuán)隊(duì)在Molecular Cancer（IF=37.3）發(fā)表文章“CircXRN2 suppresses tumor progression driven by histone lactylation through activating the Hippo pathway in human bladder cancer”。本研究發(fā)現(xiàn)circXRN2通過(guò)穩(wěn)定LATS1激活Hippo通路，進(jìn)而抑制人類膀胱癌中H3K18乳酸化驅(qū)動(dòng)的腫瘤進(jìn)展。研究結(jié)果提供了一種環(huán)狀RNA參與膀胱癌發(fā)生的分子機(jī)制，并拓展了我們對(duì)膀胱癌中Hippo通路和組蛋白乳酸化的理解。

LATS1在膀胱癌中表達(dá)下調(diào)，并與circXRN2相互作用

LATS1是Hippo信號(hào)通路中一個(gè)重要的促進(jìn)分子，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。組織芯片和臨床樣本顯示，與鄰近正常組織相比，膀胱癌組織中的LATS1異常下調(diào)。RIP和高通量測(cè)序等方法發(fā)現(xiàn)circXRN2（hsa_circ_0001134）對(duì)LATS1蛋白的結(jié)合效率和親和力最高。通過(guò)qRT-PCR也證實(shí)了在臨床腫瘤組織中circXRN2的失調(diào)。另外，circXRN2在腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平在一定程度上與Hippo通路關(guān)鍵分子TAZ和YAP的激活相關(guān)。綜上所述，circXRN2可能參與了LATS1和Hippo信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。

CircXRN2在體內(nèi)外均能抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移

在體外實(shí)驗(yàn)中，CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了circXRN2抑制膀胱癌細(xì)胞活力，細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)也表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。此外，過(guò)表達(dá)circXRN2也會(huì)引發(fā)細(xì)胞凋亡，并降低了細(xì)胞的遷移能力。

在體內(nèi)研究中，作者構(gòu)建了裸鼠皮下異種移植物腫瘤發(fā)生模型和尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型。結(jié)果表明，circXRN2可以降低皮下腫瘤的生長(zhǎng)速率和重量。同樣，circXRN2過(guò)表達(dá)組的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)量遠(yuǎn)低于陰性對(duì)照組。

總的來(lái)說(shuō)，circXRN2在體內(nèi)外均能抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移。

CircXRN2可以阻止LATS1被SPOP降解

為了揭示circXRN2和LATS1之間的相互作用，作者構(gòu)建了表達(dá)LATS1不同片段的質(zhì)粒，RIP結(jié)果顯示，LATS1蛋白的片段2與circXRN2相互作用。過(guò)表達(dá)circXRN2在蛋白水平上上調(diào)了LATS1，但不上調(diào)了mRNA水平。推測(cè)circXRN2可能通過(guò)翻譯后修飾調(diào)節(jié)LATS1蛋白水平。為了證實(shí)這一推測(cè)，通過(guò)真核蛋白合成抑制劑CHX處理陰性對(duì)照和過(guò)表達(dá)circXRN2的細(xì)胞，顯示circXRN2可以延長(zhǎng)LATS1蛋白的半衰期。蛋白酶體抑制劑bortezomib恢復(fù)了能抗circXRN2的腫瘤細(xì)胞中LATS1蛋白的表達(dá)水平。通過(guò)IP檢測(cè)不同細(xì)胞中LATS1蛋白的泛素化情況。在使用蛋白酶體的抑制劑和去泛素化酶抑制劑的過(guò)表達(dá)circXRN2的細(xì)胞中，LATS1蛋白的泛素化程度較少。綜上所述，circXRN2通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后泛素化來(lái)調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞中的LATS1蛋白水平。

LATS1是散斑型POZ的潛在底物（SPOP，E3泛素連接酶適配器），而SPOP促進(jìn)LATS1 的泛素化和降解。因此，為了驗(yàn)證SPOP參與了人膀胱癌細(xì)胞中LATS1的泛素化和降解，在T24細(xì)胞中進(jìn)行了IP和質(zhì)譜檢測(cè)，結(jié)果表明LATS1與SPOP蛋白相互作用，并且SPOP反向調(diào)控LATS1蛋白，且呈劑量依賴性。另外，敲低SPOP也降低了LATS1蛋白的泛素化水平。

大多數(shù)SPOP底物具有SPOP結(jié)合共識(shí)基序F-PS-S/T-S/T（“F”代表非極性，“P”代表極性）。在LATS1蛋白的n端有兩個(gè)推測(cè)的SPOP結(jié)合基序SBC1和SBC2。circXRN2與含有SBC1和SBC2的片段2相互作用。因此作者推測(cè)circXRN2和SPOP可能與LATS1蛋白競(jìng)爭(zhēng)性地相互作用，以調(diào)節(jié)其降解。

為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，作者構(gòu)建了野生型或突變型LATS1質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染到293T或膀胱癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)SBC1突變導(dǎo)致SPOP介導(dǎo)的LATS1降解被顯著阻斷，而SBC2的突變幾乎沒(méi)有效果。同時(shí)，co-IP結(jié)果顯示，野生型LATS1可以與SPOP結(jié)合，但SBC1突變型LATS1與SPOP的無(wú)相互作用。最后，作者發(fā)現(xiàn)敲低 circXRN2 促進(jìn)了膀胱癌細(xì)胞中SPOP與LATS1的相互作用。綜上所述，circXRN2可以阻止LATS1的SPOP介導(dǎo)的降解。

CircXRN2是膀胱癌中糖酵解和乳酸產(chǎn)生的抑制因子

Hippo通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞糖酵解代謝，鑒于circXRN2、LATS1和Hippo通路之間的密切關(guān)系，作者假設(shè)circXRN2在膀胱癌細(xì)胞的糖酵解中起著關(guān)鍵作用。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，作者過(guò)表達(dá)了circXRN2，并進(jìn)行了2-NBDG攝取檢測(cè)、葡萄糖攝取測(cè)定和乳酸生成測(cè)定。結(jié)果證明，circXRN2降低了T24和TCCSUP細(xì)胞中的葡萄糖攝取和乳酸生成。海馬糖酵解速率分析的結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)circXRN2的膀胱癌細(xì)胞的糖PER、基礎(chǔ)糖酵解和代償性糖酵解均低于正常腫瘤細(xì)胞。綜上所述，circXRN2在膀胱癌細(xì)胞的糖酵解和乳酸代謝中起負(fù)面作用。

CircXRN2通過(guò)穩(wěn)定LATS1介導(dǎo)Hippo通路，以調(diào)節(jié)膀胱癌的進(jìn)展、糖酵解和乳酸生成

作者為了證實(shí)circXRN2/LATS1軸調(diào)控膀胱腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)功能和葡萄糖代謝，在過(guò)表達(dá)circXRN2的細(xì)胞中敲低LATS1蛋白。免疫印跡分析顯示在過(guò)表達(dá)circXRN2細(xì)胞中，LATS1蛋白和Hippo通路關(guān)鍵蛋白TAZ/YAP表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)，免疫熒光也表明CircXRN2改變了膀胱癌細(xì)胞中TAZ/YAP的位置。

CCK-8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，shLATS1逆轉(zhuǎn)了circXRN2對(duì)細(xì)胞活力和增殖的抑制作用。同時(shí)，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)和傷口愈合實(shí)驗(yàn)表明。與circxrn2過(guò)表達(dá)的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染shLATS1的細(xì)胞遷移能力更強(qiáng)。

此外，對(duì)照組、circXRN2-過(guò)表達(dá)組和 circXRN2+shLATS1組的葡萄糖攝取能力和乳酸生成分別通過(guò)2-NBDG攝取測(cè)定、葡萄糖攝取測(cè)定和乳酸生成檢測(cè)來(lái)確定。結(jié)果顯示，shLATS1減輕了circXRN2對(duì)糖酵解代謝的抑制。

circXRN2調(diào)控組蛋白乳酸化促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生

組蛋白乳酸化依賴于糖酵解或其他代謝過(guò)程產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)乳酸。因此，作者利用2-DG（一種糖酵解抑制劑）和草酸酯（一種乳酸脫氫酶抑制劑）來(lái)證實(shí)膀胱癌細(xì)胞中糖酵解、總?cè)樗峄徒M蛋白乳酸化之間的關(guān)系。2-DG和草酸酯以劑量依賴的方式降低了總?cè)樗峄徒M蛋白H3K18乳酸化水平，而乳酸脫氫酶LDH則完全抑制了這一趨勢(shì)。同時(shí)，circXRN2顯著降低了總?cè)樗峄虷3K18乳酸化水平。值得注意的是，在膀胱癌細(xì)胞系中，總?cè)樗峄虷3K18乳酸化水平是顯著升高的，這表明其在腫瘤發(fā)生中的潛在作用。

所以，作者接著驗(yàn)證H3K18乳酸化在膀胱癌中的生物學(xué)功能，通過(guò)消siLDHA/B以降低總?cè)樗峄虷3K18乳酸化水平，CCK-8和菌落形成實(shí)驗(yàn)表明，H3K18乳酸化在細(xì)胞增殖和集落形成能力起著至關(guān)重要的作用。此外，siLDHA/B還會(huì)損害膀胱癌細(xì)胞的遷移能力。綜上所述，這些結(jié)果表明組蛋白H3K18的乳酸化是由circXRN2調(diào)節(jié)的，并參與了膀胱癌的腫瘤發(fā)生。

LCN2是H3K18乳酸化的靶點(diǎn)，在膀胱癌中作為致癌基因

作者接著研究了H3K18乳酸化的調(diào)控機(jī)制，CUT&Tag和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，H3K18la可以在許多基因的啟動(dòng)子區(qū)域富集，同時(shí)，H3K18la相關(guān)基因也在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的多種信號(hào)通路中富集。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并與CUT&Tag數(shù)據(jù)和PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，作者選取了LCN2、NRARP 和KRT80作為候選基因，然后發(fā)現(xiàn)，在過(guò)表達(dá)circXRN2的膀胱癌細(xì)胞中，LCN2被circXRN2顯著下調(diào)。此外，2-DG也在蛋白水平上調(diào)節(jié)LCN2的表達(dá)。

LCN2是一種癌癥進(jìn)展的促進(jìn)因子，在膀胱癌組織中表達(dá)上調(diào)。為了進(jìn)一步研究其功能，作者針對(duì)LCN2啟動(dòng)子設(shè)計(jì)了不同區(qū)域的特異性引物，ChIP實(shí)驗(yàn)顯示H3K18la富集在LCN2啟動(dòng)子中，且H3K18la與LCN2啟動(dòng)子之間的相互作用可以被2-DG和circXRN2降低，進(jìn)一步表明H3K18la在LCN2轉(zhuǎn)錄中的關(guān)鍵作用。最后，LCN2的敲低顯著地降低了細(xì)胞的增殖、菌落的形成和增殖腫瘤細(xì)胞的遷移。綜上所述，LCN2直接受H3K18乳酸化調(diào)控，并在人類膀胱癌中發(fā)揮致癌基因的作用。

CircXRN2-LATS1軸在體內(nèi)抑制膀胱癌細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

為了驗(yàn)證circXRN2-LATS1軸是否能抑制膀胱癌細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，作者將轉(zhuǎn)染（對(duì)照、circXRN2過(guò)表達(dá)、circXRN2+shLATS1）的細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)。與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相似，過(guò)表達(dá)circXRN2顯著降低腫瘤的生長(zhǎng)速率，而敲低LATS1可顯著減弱circXRN2的抑制效果。作者又構(gòu)建了裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)circXRN2顯著減少了肺轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，而circXRN2+shLATS1組中，結(jié)節(jié)顯著增加。此外，通過(guò)免疫組化和免疫印跡檢測(cè)了不同治療組腫瘤中LATS1、TAZ/YAP、LCN2和H3K18la的表達(dá)水平，與上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。綜上所述，circXRN2通過(guò)調(diào)控Hippo信號(hào)通路來(lái)抑制人膀胱癌中H3K18乳酸化介導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展。

總結(jié)

本研究探索了環(huán)狀RNA的一種新的分子機(jī)制，并為環(huán)狀RNA和H3K18乳酸化調(diào)節(jié)人膀胱癌的腫瘤進(jìn)展提供了具體的證據(jù)。特別地，circXRN2通過(guò)調(diào)節(jié)H3K18乳酸化來(lái)抑制膀胱癌的進(jìn)展。在機(jī)制上，circXRN2與LAST1蛋白結(jié)合，保護(hù)其免受SPOP介導(dǎo)的泛素化降解，隨后調(diào)控Hippo信號(hào)通路，抑制H3K18乳酸化。本研究結(jié)果將有助于發(fā)現(xiàn)人類膀胱癌新的分子靶點(diǎn)和治療策略。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1186/s12943-023-01856-1