01

前言

近十年來(lái)，冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)已成為解析結(jié)構(gòu)的重要方法之一。單顆粒冷凍電鏡與X射線晶體衍射學(xué)、核磁共振相互補(bǔ)充，為理解生物學(xué)界的生理病理過(guò)程提供了重要的基礎(chǔ)依據(jù)。隨著技術(shù)的進(jìn)步，冷凍電鏡方法逐漸成為蛋白原子分辨率結(jié)構(gòu)解析的常規(guī)方法。

雖然冷凍電鏡的技術(shù)革新帶領(lǐng)我們進(jìn)入到了原子分辨率時(shí)代，但是對(duì)于小蛋白應(yīng)用冷凍電鏡的普適性仍受限，也存在更高的技術(shù)門檻。目前，基于冷凍電鏡的小蛋白高分辨率結(jié)構(gòu)解析主要存在兩個(gè)問(wèn)題：

1. 由于小蛋白粒徑相對(duì)于冰層的厚度較小，導(dǎo)致獲得的信噪比較低，從而影響了結(jié)構(gòu)的分辨率

2. 小蛋白的形態(tài)特征并不明顯，更難解析高分辨結(jié)構(gòu)

為了解決這些問(wèn)題，也為了更好的探究與小蛋白相關(guān)的科學(xué)問(wèn)題，科學(xué)家們發(fā)展出了多個(gè)方法來(lái)幫助小蛋白的結(jié)構(gòu)解析。其中，增加小蛋白的蛋白質(zhì)分子量，成為一個(gè)重要的應(yīng)用方向，特別是使用Nanobody-based Assemblies，F(xiàn)usion Tags和Symmetric Scaffolds等方法來(lái)幫助小蛋白高分辨結(jié)構(gòu)解析。

02

GPCR策略

作為跨膜蛋白的最大家族，G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptors, GPCRs）識(shí)別的信號(hào)分子種類繁多，如離子、多肽和脂類等，這類受體介導(dǎo)的信號(hào)通路與諸多生命活動(dòng)和病理現(xiàn)象密切相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，30-40%上市藥靶向GPCRs。毋庸置疑，GPCR家族的三維結(jié)構(gòu)信息極大地促進(jìn)了對(duì)GPCRs生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)和靶向GPCR的藥物研發(fā)。

與傳統(tǒng)的晶體學(xué)手段相比，冷凍電鏡技術(shù)（cryo-EM）在解析生物大分子高分辨率結(jié)構(gòu)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，例如無(wú)須獲得晶體、所需樣品量小和樣品制備方式多樣等，且已被廣泛應(yīng)用于解析激活GPCR與下游蛋白的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。

然而，約85% GPCRs的大部分區(qū)域包埋在脂膜環(huán)境中，這導(dǎo)致非激活GPCRs在未結(jié)合下游蛋白時(shí)其冷凍電鏡數(shù)據(jù)處理仍具有十分重大的挑戰(zhàn)。因此，通過(guò)生化手段引入輔助性工具蛋白將極大地促進(jìn)冷凍電鏡技術(shù)在解析GPCRs非激活狀態(tài)上的應(yīng)用，從而加深對(duì)GPCRs不同生理狀態(tài)和生物學(xué)功能的理解。為融合蛋白策略和cryo-EM技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)路線在GPCRs（甚至是其他小型膜蛋白）結(jié)構(gòu)解析中的有效應(yīng)用提供了思路。