注：本文不構(gòu)成任何投資意見和建議，以官方/公司公告為準(zhǔn)；本文僅作醫(yī)療健康相關(guān)藥物介紹，非治療方案推薦（若涉及），不代表耀海生物立場。任何文章轉(zhuǎn)載需得到授權(quán)。前言前段時間好幾天沒有更新，因?yàn)榫瓣枴崩玻瓤?，這頭疼發(fā)燒的日子真是一點(diǎn)都不好過，不知道大家的情況怎么樣呢？那今天菌菌想跟大家聊聊的就是我們檢測新冠病毒時候用到的手段——PCR特異性擴(kuò)增技術(shù)，主要是帶大家了解一下如何提高PCR特異性擴(kuò)增率。原理部分想必不用再提，有遺忘的小伙伴趕緊點(diǎn)開筆記【星耀小課堂】PCR擴(kuò)增技術(shù)原理復(fù)習(xí)哦。PCR擴(kuò)增，polymerase chain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，顧名思義就是利用DNA聚合酶在引物起始下去延伸我們的目標(biāo)產(chǎn)物，也就是DNA片段，其實(shí)就是一個個人為創(chuàng)造的DNA復(fù)制的過程。即使分子片段極小，也能經(jīng)過數(shù)次循環(huán)擴(kuò)增出許多產(chǎn)物，這就是它的高效之處。耀海生物在獲取目的基因片段時通常采用PCR擴(kuò)增技術(shù)，通常以質(zhì)粒為模板，以同源重組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)置成熟的擴(kuò)增體系與條件，擴(kuò)增產(chǎn)物再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離檢測。那講PCR特異性擴(kuò)增，我們先從它的反面來理解它。PCR技術(shù)的非特異性擴(kuò)增是指擴(kuò)增出來的條帶不是我們所需要的，且引物與模板在非目的條帶處有錯配，導(dǎo)致延伸產(chǎn)物不是目的條帶，表現(xiàn)在在瓊脂糖電泳時可以看到在目的條帶外出現(xiàn)了其他條帶。
提高PCR特異性擴(kuò)增的方法：

1.設(shè)計(jì)引物

引物序列的GC 含量以40-60%為宜，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶，引物長度（primer length）常用的是15-30bp，常用為20bp左右。引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C。關(guān)于引物設(shè)計(jì)相關(guān)要點(diǎn)菌菌此前介紹過，小伙伴直接戳【星耀小課堂】PCR擴(kuò)增技術(shù)之引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)。2.熱啟動PCRPCR 反應(yīng)的最初加熱過程中，樣品溫度上升到70℃之前，在較低的溫度下引物可能與部分單鏈模板形成非特異性結(jié)合，并在Taq DNA 聚合酶的作用下延伸。Taq DNA 聚合酶通常在比適宜溫度低得多的條件下仍有較強(qiáng)的活性。結(jié)果會導(dǎo)致非靶序列的擴(kuò)增，影響反應(yīng)的特異性。熱啟動PCR（hot start PCR）是指使Taq DNA 聚合酶只有在樣品溫度至少超過70℃時才發(fā)揮作用的PCR，可提高反應(yīng)的特異性。熱啟動可減少非靶序列的擴(kuò)增，提高反應(yīng)的特異性。其基本方法是: 進(jìn)行反應(yīng)之前，將Taq DNA 聚合酶、dNTP 和引物等先不要加人樣品管內(nèi)，而是將樣品加熱，待溫度升到70℃ 以上時，再將上述試劑加入，開始PCR反應(yīng)。但這種延緩加入Taq DNA 聚合酶的手工熱啟動方法十分煩瑣，最有效的方法就是使用熱啟動Taq酶(或熱啟動高保真聚合酶）去擴(kuò)增，它的原理就是采用化學(xué)修飾的方法封閉酶的活性中心，當(dāng)溫度上升到95°C時恢復(fù)活性，指導(dǎo)擴(kuò)增。3.降落PCR退火溫度過低則會使非特異擴(kuò)增過多降落PCR提供了一個較為簡易的優(yōu)化方法。其原理大致是這樣的。首先在較高的溫度下擴(kuò)增，此時雖然擴(kuò)增效率低，但非特異擴(kuò)增基本沒有。隨著退火溫度的降低，非特異擴(kuò)增會逐步增多。但由于此時特異的擴(kuò)增產(chǎn)物已經(jīng)達(dá)到一定的數(shù)量優(yōu)勢，因此會對非特異擴(kuò)增產(chǎn)生強(qiáng)烈的競爭抑制，從而大幅提高PCR的特異性和效率。這一PCR技術(shù)已經(jīng)大量地進(jìn)入醫(yī)療臨床應(yīng)用。具體方法是調(diào)整PCR循環(huán)的參數(shù)。在降落PCR中，前面幾個循環(huán)的退火溫度設(shè)定為比引物的最高熔解溫度（Tm）高幾度。較高的溫度有助于避免產(chǎn)生引物二聚體及非特異性引物-模板復(fù)合物的形成。需要注意的是，雖然較高的退火溫度能夠防止引物二聚體形成和非特異性引物結(jié)合，但同時也可能加劇引物與目的序列的解離，從而降低PCR得率。為克服這一問題，在最初幾個循環(huán)中，通常會將每個循環(huán)的退火溫度再降低1°C，以獲得足量的目標(biāo)擴(kuò)增子。一旦退火溫度達(dá)到或“降落”至最佳溫度（通常比最低引物Tm低3-5°C），剩下的循環(huán)都維持此退火溫度。4.巢式PCR巢式PCR是標(biāo)準(zhǔn)PCR的一種演變，其增強(qiáng)了反應(yīng)特異性和目標(biāo)擴(kuò)增子的產(chǎn)量。在此方法中，使用兩對（而非一對）PCR引物擴(kuò)增完整的片段：第一對PCR引物（外引物）擴(kuò)增片段和普通PCR相似。在目標(biāo)擴(kuò)增區(qū)域的側(cè)翼，另一對（巢式引物）對應(yīng)于待擴(kuò)增的DNA區(qū)域。其中，外引物用于第一輪PCR，以擴(kuò)增含有延伸側(cè)翼區(qū)域的區(qū)域。隨后，巢式引物用于第二輪PCR，并以第一輪PCR產(chǎn)物為模板。第二對引物稱為巢式引物（因?yàn)樗麄冊诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯誤片段，則第二次能在錯誤片段上進(jìn)行引物配對并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異。PCR技術(shù)具有許多的“變形”，但是萬變不離其宗，它的“根兒”就是解鏈-退火-延伸三個步驟，只要牢牢把握這個核心，那關(guān)于它的優(yōu)化技術(shù)也就很好理解了~菌菌身為耀海人，常常接觸PCR技術(shù)，大家對此有任何疑問都可以咨詢我哦~疫情當(dāng)下，“小陽人”們記得不熬夜、多休息，照顧好自己，未陽的小伙伴堅(jiān)持做好防護(hù)~咱們下期再見
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