前面幾期內(nèi)容小編就CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除實驗流程及sgRNA的設(shè)計進(jìn)行了整理分享?；蚯贸龑嶒炓话阋?jīng)過以下幾個過程：確定敲除目標(biāo)基因及細(xì)胞→根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計sgRNA序列→構(gòu)建sgRNA及Cas9表達(dá)載體（質(zhì)粒、病毒等）→轉(zhuǎn)染細(xì)胞→篩選陽性混合克隆→挑選并培養(yǎng)單克隆→檢測編輯效率，鑒定敲除類型→成功建立KO細(xì)胞系。本期內(nèi)容，小編整理了幾種CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯效率驗證的常用方法，供小伙伴們參考。

一、SSA活性檢測，適用于初步檢測sgRNA活性，排除無活性sgRNA。

圖1.基于同源定向修復(fù)（HDR）/單鏈退火（SSA）的sgRNA活性檢測熒光報告系統(tǒng)

（圖片來源：Yang Y?at,?2016）

單鏈復(fù)性(Single-strand annealing，SSA)檢測，可以驗證打靶質(zhì)粒是否具有切割裸露DNA的能力，是初步評估CRISPR-Cas9系統(tǒng)有活性的常用方法。與基于HDR的活性驗證相比具有更高的靈敏性和準(zhǔn)確度。將熒光蛋白編碼序列分為前后兩段，前一段的最后200bp與后一段的前面200bp為同源序列，將兩端序列分別克隆至SSA報告質(zhì)粒中，在兩者中間插入含有一個終止密碼子和一段sgRNA的靶序列。當(dāng)常規(guī)質(zhì)粒sgRNA特異性檢測載體單獨轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中時，不會觀察到綠色熒光。然而，如果將該載體與Cas9和相應(yīng)的sgRNA載體一起共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，則sgRNA-Cas9復(fù)合物將被募集到兩段熒光蛋白編碼序列之間的sgRNA靶序列上，從而切割使雙鏈DNA斷裂，隨后熒光蛋白前段序列與后段序列的同源區(qū)域發(fā)生同源重組。同源重組后將產(chǎn)生完整的功能性熒光蛋白編碼序列，繼而表達(dá)綠色熒光蛋白。通過分析熒光細(xì)胞的比例，比較不同sgRNA靶位點被CRISPR/Cas9編輯的效率。另外，在該系統(tǒng)中，可以在熒光蛋白前后兩端序列之間串聯(lián)克隆多個sgRNA靶位點（每個都應(yīng)包含PAM序列），通過與Cas9和相應(yīng)的sgRNA共轉(zhuǎn)染分別測試。此方法的缺陷在于要同時向工具細(xì)胞轉(zhuǎn)染Cas9/sgRNA以及報告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染效率對最終的編輯效率分析會產(chǎn)生較大的影響。另外正式實驗中目標(biāo)位點可能受到染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和表觀遺傳狀態(tài)的影響，所以此方法評估的結(jié)果僅可作為排除無活性sgRNA的依據(jù)，而非篩選活性sgRNA。

?二、錯配酶切法鑒定編輯效率。適用于混合克隆或單克隆打靶驗證，簡單直觀但無法判斷具體突變類型及序列。

錯配酶切法可以有效的切割鑒定DNA中存在的不配對的堿基。提取對照組和實驗組細(xì)胞基因組，并且在編輯位點前后設(shè)計引物進(jìn)行PCR，再將對照組和實驗組的PCR產(chǎn)物混合退火。野生型和突變型PCR產(chǎn)物雜交，就會產(chǎn)生存在不配對的堿基。核酸錯配酶就會識別切割DNA中不匹配的堿基位點，并在錯配處切割PCR產(chǎn)物，根據(jù)最后的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析DNA的切割率。目前錯配酶法鑒定基因編輯效率應(yīng)用較多的是T7E1，T7E1不僅可以切割DNA中雙鏈中不匹配的堿基，也可以切割十字形DNA結(jié)構(gòu)、DNA分叉點以及異源二聚體DNA等，因此會存在假陽性率。此外還有CEL1酶也可進(jìn)行堿基的錯配鑒定。

圖2. T7E1酶檢測切割情況流程示意圖

具體實驗細(xì)節(jié)：

1、?引物設(shè)計：?上下游引物距離切割位點長度不要一樣長，保證T7E1錯配酶切割過的DNA序列呈現(xiàn)出有長有短，這樣瓊脂糖電泳后呈現(xiàn)的就是上下不同的條帶，且保證靶點距上下游引物均在100bp以上。

2、?制備待檢測DNA片段：一般利用設(shè)計的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得待測混合克隆DNA片段。如果待測樣品本身是單克隆樣品，則還需通過PCR獲取野生型樣品DNA片段。

3、?混合克隆DNA片段或待檢單克隆DNA片段與野生型樣品DNA片段等量混合，另以野生型DNA作為陰性對照。按照以下步驟進(jìn)行退火反應(yīng)：待測DNA樣品1-3ug+緩沖液3ul+ddH2O將總反應(yīng)體積補充至30ul。反應(yīng)條件：98℃反應(yīng)10min，緩慢降溫至室溫。

4、?將經(jīng)退火處理的DNA樣品20ul與T7E1核酸錯配酶0.5ul混勻，37℃酶切30min；

5、?電泳分析一般使用1.8%濃度的瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物，若片段較短，建議使用0.5×TBE?buffer效果更佳。

注意：不同試劑盒反應(yīng)條件及時間有所調(diào)整，請根據(jù)具體試劑盒指南進(jìn)行以上操作。

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三、sanger測序，最精確，可直觀展示編輯后的DNA序列。

在成功獲得混合克隆或單克隆細(xì)胞后提取基因組DNA進(jìn)行sanger測序，可判斷敲除效果或敲除類型：

1、?混合克隆：測序圖譜在PAM附近出現(xiàn)套峰，混合克隆中有成功敲除的單克隆。

2、?單克隆細(xì)胞株：對照野生型細(xì)胞基因測序結(jié)果確定所挑單克隆細(xì)胞的突變類型及具體突變序列。單克隆敲除細(xì)胞株sanger測序可能出現(xiàn)的幾種情況：

?圖3：不同情況測序結(jié)果示意圖

四、WB檢測，適用于獲取不同的敲除單克隆細(xì)胞株后的檢測，鑒定目標(biāo)基因功能是否被完全敲除最徹底的方法。提取部分單克隆細(xì)胞株蛋白，利用特異性抗體進(jìn)行WB檢測目的蛋白是否表達(dá)，通過結(jié)果分析敲除效果。若抗體特異性好（條帶單一）還可以簡化為Dot blot，同時快速檢測多個單克隆細(xì)胞株的敲除情況。

圖4. Dot blot結(jié)果示意圖

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參考文獻(xiàn)：

[1] Yang Y, Liu S, Cheng Y, Nie L, Lv C, Wang G, Zhang Y, Hao L. Highly Efficient and Rapid Detection of the Cleavage Activity of Cas9/sgRNA via a Fluorescent Reporter. Appl Biochem Biotechnol. 2016 Oct;180(4):655-667. doi: 10.1007/s12010-016-2122-8.

[2] Ehrke-Schulz E, Bergmann T, Schiwon M, Doerner J, Saydaminova K, Lieber A, Ehrhardt A. Quantification of designer nuclease induced mutation rates: a direct comparison of different methods. Mol Ther Methods Clin Dev. 2016 Jul 6;3:16047. doi: 10.1038/mtm.2016.47.

[3] Smits AH, Ziebell F, Joberty G, Zinn N, Mueller WF, Clauder-Münster S, Eberhard D, F?lth Savitski M, Grandi P, Jakob P, Michon AM, Sun H, Tessmer K, Bürckstümmer T, Bantscheff M, Steinmetz LM, Drewes G, Huber W. Biological plasticity rescues target activity in CRISPR knock outs. Nat Methods. 2019 Nov;16(11):1087-1093. doi: 10.1038/s41592-019-0614-5.