變性階段

• 在此階段，包含模板 DNA 和所有其他核心成分的混合物被加熱到 94-95?C。

• 高溫導(dǎo)致氫鍵在兩條模板 DNA 鏈中的堿基之間斷裂，兩條鏈分開。

• 這會(huì)產(chǎn)生兩條單鏈 DNA，它們將充當(dāng)生成新 DNA 鏈的模板。

• 重要的是，溫度在此階段保持足夠長的時(shí)間以確保 DNA 鏈完全分離。

• 這通常需要 15-30 秒。

退火階段

在此階段，反應(yīng)冷卻至 50-65?C。這使得引物能夠通過氫鍵結(jié)合到單鏈模板 DNA 的特定位置（確切的溫度取決于您使用的引物的熔化溫度）。

引物是單鏈DNA或者RNA：長度約為 20 到 30 個(gè)堿基的序列。

引物設(shè)計(jì)成互補(bǔ)的：在要復(fù)制的序列的每一端按順序排列成短的 DNA 片段。

引物是 DNA 合成的起點(diǎn)。聚合酶只能將 DNA 堿基添加到 DNA 雙鏈中。只有當(dāng)引物結(jié)合后，聚合酶才能附著并開始從松散的 DNA 堿基中制造新的 DNA 互補(bǔ)鏈。

兩條分開的 DNA 鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，并且方向相反（從一端 - 5' 端 - 到另一端 - 3' 端）；因此，有兩種引物——正向引物和反向引物。

此步驟通常需要大約 10-30 秒。

延伸階段

在最后一步中，熱量增加到 72?C，使新的 DNA 能夠通過添加 DNA 堿基的特殊 Taq DNA 聚合酶生成。

Taq DNA 聚合酶是一種從喜熱細(xì)菌中提取的酶。這種細(xì)菌通常生活在溫泉中，因此可以承受 80?C 以上的溫度。

細(xì)菌的 DNA 聚合酶在高溫下非常穩(wěn)定，這意味著它可以承受在 PCR 變性階段將 DNA 鏈分開所需的溫度。

72?C 是 Taq 聚合酶構(gòu)建互補(bǔ)鏈的最佳溫度。它附著在引物上，然后以 5' 到 3' 的方向?qū)?DNA 堿基一個(gè)接一個(gè)地添加到單鏈上。

結(jié)果是一條全新的 DNA 鏈和一個(gè)雙鏈 DNA 分子。

此步驟的持續(xù)時(shí)間取決于被擴(kuò)增的 DNA 序列的長度，但通常需要大約一分鐘來復(fù)制 1,000 個(gè) DNA 堿基 (1Kb)。

這三個(gè)熱循環(huán)過程重復(fù) 20-40 次以產(chǎn)生大量感興趣的 DNA 序列拷貝。

圖2：顯示聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 如何產(chǎn)生大量 DNA 拷貝。