乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，其新發(fā)病例和死亡人數(shù)居世界第一。人表皮生長因子受體2（HER2）陽性乳腺癌作為一種特殊的亞型，其特征是侵襲性和預(yù)后不良。曲妥珠單抗是一種人源化單克隆抗體，在臨床前和臨床試驗中均顯示出相當(dāng)大的抗腫瘤療效。然而，很大比例的患者最終會對曲妥珠單抗產(chǎn)生耐藥性，這極大地限制了其臨床應(yīng)用。而NRF2高表達(dá)的HER2乳腺癌患者在接受曲妥珠單抗治療后的無進(jìn)展生存期更短，表明NRF2對曲妥珠單抗耐藥至關(guān)重要。另外，部分環(huán)狀RNA已被證明可以直接翻譯成功能蛋白，參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)展。那么它們是否與曲妥珠單抗的耐藥性有關(guān)，以及與NRF2蛋白之間的關(guān)系，還需要進(jìn)一步研究。

2023年9月28日，西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院Zeng Kaixuan在Redox Biology（IF=11.4）發(fā)表文章“The novel β-TrCP protein isoform hidden in circular RNA confers trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer”。本研究揭示了一種由環(huán)狀RNA編碼多肽驅(qū)動曲妥珠單抗耐藥的新機(jī)制，同時為抗腫瘤藥物復(fù)敏策略提供了概念驗證和理論基礎(chǔ)。

circ-β-TrCP在曲妥珠單抗耐藥的HER2陽性乳腺癌中表達(dá)上調(diào)

作者篩選了曲妥珠單抗耐藥乳腺癌細(xì)胞（BT474-TR）和BT474細(xì)胞之間環(huán)狀RNA的差異表達(dá)。并采用qRT-PCR檢測驗證發(fā)現(xiàn)circ-β-TrCP在BT474-TR細(xì)胞中上調(diào)率最高（圖1A-B），因此選擇其進(jìn)行后續(xù)研究。同樣，circ-β-TrCP在人耐曲妥珠單抗的乳腺癌組織中過表達(dá)（圖1C），且表達(dá)高circ-β-TrCP的患者比表達(dá)低circ-β-TrCP的患者總生存時間更短（圖1C-D）。序列比對結(jié)果顯示，circ-β-TrCP來源于β-TrCP前mRNA第7和13外顯子的反向剪接，全長913 bp（圖1F-G）。RNase R酶進(jìn)一步驗證了circ-β-TrCP的穩(wěn)定性，且半衰期更長（圖1H-M），另外，qRT-PCR和FISH結(jié)果顯示，circ-β-TrCP主要位于曲妥珠單抗敏感和耐藥細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖1N-R），表明在曲妥珠單抗耐藥過程中，circ-β-TrCP的定位沒有改變。綜上所述，circ-β-TrCP是一種細(xì)胞質(zhì)環(huán)狀RNA，可能對曲妥珠單抗的耐藥性至關(guān)重要。

circ-β-TrCP促進(jìn)曲妥珠單抗耐藥性

作者使用CRISPR/Cas13d系統(tǒng)敲低曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞中的內(nèi)源性circ-β-TrCP，并建立了穩(wěn)定的細(xì)胞系（圖2A）。CCK-8的結(jié)果顯示，在曲妥珠單抗治療后，circ-β-TrCP敲低后，細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞集落形成較少，ROS水平升高（圖2C-F）。此外，作者在BT474和SKBR3細(xì)胞中過表達(dá)circ-β-TrCP，細(xì)胞集落形成和細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)，而ROS水平在曲妥珠單抗治療后降低（圖2G-K）。

接著作者建立原位移植腫瘤模型，評估circ-β-TrCP對曲妥珠單抗耐藥的體內(nèi)影響。將BT474-TR細(xì)胞原位注射到NOD/SCID小鼠的腹部乳腺脂肪墊中，然后每周給藥曲妥珠單抗（圖2L）。結(jié)果顯示，BT474-TR來源的腫瘤對曲妥珠單抗具有高度耐藥性，但敲低circ-β-TrCP后，腫瘤體積明顯較小（圖2N-P）。相比之下，在接受曲妥珠單抗治療后，BT474來源的腫瘤體積減小，而過表達(dá)circ-β-TrCP顯著降低了曲妥珠單抗的治療效果（圖2Q-U）。綜上所述，體外和體內(nèi)的結(jié)果表明，circ-β-TrCP是曲妥珠單抗耐藥性的驅(qū)動因素。

circ-β-TrCP通過編碼β-TrCP-343aa促進(jìn)曲妥珠單抗耐藥性

作者通過對TransCirc數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)circ-β-TrCP可能在連接位點編碼一個343個氨基酸的蛋白，預(yù)測分子量為36 KDa，命名為β-TrCP-343aa（圖3A）。為了檢測circ-β-TrCP是否可翻譯，作者構(gòu)建了帶circ-β-TrCPOE載體、circ-β-TrCPOE/Flag載體和circ-β-TrCPmut/flag突變載體（圖3 B-C）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染circ-β-TrCPOE/Flag組在35 KDa附近檢測到Flag條帶。質(zhì)譜分析進(jìn)一步驗證了β-TrCP-343aa的存在（圖3D-E）。同時，在轉(zhuǎn)染circ-β-TrCP過表達(dá)載體的細(xì)胞中，該蛋白信號顯著增強(qiáng)，circ-β-TrCPmut/flag載體沒有變化（圖3 D-E）。熒光結(jié)果顯示，circ-β-TrCP和β-TrCP-343aa分別主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中（圖3F）。此外，與曲妥珠單抗敏感的對照組相比，β-TrCP-343aa在曲妥珠單抗耐藥的細(xì)胞和組織中過表達(dá)（圖3G-I）。circ-β-TrCP的敲低顯著降低了BT474-TR和SKBR3-TR細(xì)胞內(nèi)源性β-TrCP-343aa水平，而這些作用被circ-β-TrCPOE阻斷，而沒有被circ-β-TrCPmut阻斷（圖3J）。在功能上，circ-β-TrCPOE消除了在曲妥珠單抗治療后，circ-β-TrCP敲低導(dǎo)致的細(xì)胞活力降低、集落形成和ROS含量增加（圖3 K-O）。綜上所述，circ-β-TrCP編碼產(chǎn)物，而不是circ-β-TrCP本身，賦予了細(xì)胞曲妥珠單抗耐藥性。

接著作者使用RNAi篩選來確定調(diào)控circ-β-TrCP翻譯過程的因子。qRT-PCR和免疫印跡結(jié)果顯示，eIF3亞基的敲低明顯影響了β-TrCP-343aa的產(chǎn)生，而對circ-β-TrCP的表達(dá)影響不大，說明eIF3參與了circ-β-TrCP的翻譯。其中，eIF3a和eIF3b敲低降低β-TrCP-343aa水平，而eIF3j敲低與此相反，說明eIF3j通過阻斷eIF3a和eIF3b與circRNA的結(jié)合抑制circRNA翻譯（圖3 P-Q）。

然后作者采用合成的全長circ-β-TrCP和純化的eIF3j蛋白進(jìn)行體外結(jié)合實驗，結(jié)果顯示circ-β-TrCP直接與eIF3j結(jié)合（圖3 R-S）。此外，RIP和RNA pulldown實驗進(jìn)一步驗證了circ-β-TrCP和eIF3j蛋白之間的相互作用（圖T-U）。另外，在BT474-TR和SKBR3-TR細(xì)胞中，eIF3a、eIF3b和eIF3j蛋白均被circ-β-TrCP探針拉出，而在eIF3j過表達(dá)的情況下，很少或幾乎沒有eIF3a和eIF3b蛋白與circ-β-TrCP相互作用（圖V）。綜上所述，circ-β-TrCP的翻譯受到eIF3j的負(fù)調(diào)控。

β-TrCP-343aa阻斷SCFβ-TRCP介導(dǎo)的NRF2降解

鑒于β-TrCP-343aa包含β-TrCP的WD結(jié)構(gòu)域，而β-TrCP降解核NRF2，這是曲妥珠單抗耐藥的關(guān)鍵因素，推斷β-TrCP-343aa可能通過影響β-TrCP/NRF2軸發(fā)揮作用。與預(yù)期的一樣，在BT474-TR和SKBR3-TR細(xì)胞中敲低circ-β-TrCP顯著降低了NRF2蛋白水平，但可以通過恢復(fù)circ-β-TrCP的過表達(dá)來逆轉(zhuǎn)（圖4A）。與對照組細(xì)胞相比，circ-β-TrCP敲低細(xì)胞中的NRF2靶點的mRNA水平以及NRF2轉(zhuǎn)錄活性降低，這些影響可被circ-β-TrCP過表達(dá)所抵消（圖4B和C）。值得注意的是，NRF2 mRNA的豐度沒有變化（圖4B），這表明β-TrCP-343aa在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)NRF2。用環(huán)己酰亞胺（CHX）阻斷蛋白合成后，下調(diào)circ-β-TrCP后，NRF2蛋白的降解速率顯著加快（圖4D和E）。circ-β-TrCP敲低導(dǎo)致的NRF2蛋白下降被MG132（一種蛋白酶體抑制劑）阻斷，而氯喹（CQ，一種自噬抑制劑）沒有阻斷（圖4F），表明泛素蛋白酶體系統(tǒng)參與了β-TrCP-343aa介導(dǎo)的NRF2蛋白周轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)。同樣，在circ-β-TrCP敲低的細(xì)胞中，NRF2的泛素化水平顯著增加，這些作用被過表達(dá)circ-β-TrCP或線性β-TrCP-343aa所阻斷（圖4G和H）。此外，敲低circ-β-TrCP能夠在蘿卜硫素（SFN，NRF2激活劑；SFN能夠修飾KEAP1的關(guān)鍵胱氨酸殘基，以抑制NRF2泛素化）存在的情況下降低NRF2蛋白水平（圖4F）。綜上所述，β-TrCP-343aa可以穩(wěn)定NRF2蛋白，而不依賴于KEAP1。

β-TrCP和β-TrCP-343aa蛋白序列都具有與NRF2結(jié)合的WD結(jié)構(gòu)域，但β-TrCP-343aa缺少F-box結(jié)構(gòu)域，而F-box結(jié)構(gòu)域能招募SKP1-Cul1-Rbx1復(fù)合物降解NRF2（圖4J）。IP結(jié)果顯示，SKP1免疫沉淀了β-TrCP，而不是β-TrCP-343aa（圖4K）。推測β-TrCP-343aa可能與β-TrCP競爭結(jié)合NRF2，導(dǎo)致NRF2未被降解。蛋白對接模型顯示，β-TrCP-343aa比β-TrCP具有更高的NRF2結(jié)合能力（圖4L）。在BT474-TR和SKBR3-TR細(xì)胞中，通過IP檢測驗證了β-TrCP-343aa和NRF2之間的內(nèi)源性相互作用（圖4M）。此外，外源性HA-NRF2也通過circ-β-TrCP翻譯的Flag-β-TrCP-343aa免疫沉淀（圖4N）。與預(yù)期的那樣，circ-β-TrCP敲低導(dǎo)致更多的NRF2與β-TrCP結(jié)合，同時NRF2蛋白表達(dá)下降，這些現(xiàn)象被circ-β-TrCP過表達(dá)所抵消（圖4 O-P）。此外，過表達(dá)β-TrCP的BT474-TR和SKBR3-TR細(xì)胞中NRF2蛋白水平降低，而泛素化水平升高，但能被circ-β-TrCP或線性β-TrCP-343aa阻斷（圖4 Q-R）。已知β-TrCP與NRF2的Neh6結(jié)構(gòu)域結(jié)合需要GSK3磷酸化的降解子，推測β-TrCP-343aa與NRF2的結(jié)合也是如此。結(jié)果顯示，過表達(dá)β-TrCP或敲低circ-β-TrCP顯著降低了NRF2?/?細(xì)胞中的NRF2水平，而不是HA-NRF2-S4A4（NRF2的Neh6磷酸化蛋白內(nèi)的四個絲氨酸的丙氨酸替代物），這些現(xiàn)象在GSK3抑制劑SB216763處理后消失。此外，IP結(jié)果顯示，NRF2-S4A4未能與β-TrCP和β-TrCP-343aa結(jié)合（圖4T）。

綜上所述，circ-β-TrCP編碼的β-TrCP-343aa通過抑制β-TrCP/NRF2相互作用直接結(jié)合并穩(wěn)定NRF2蛋白，該相互作用獨立于KEAP1通路，但需要GSK3活性。

NRF2通過轉(zhuǎn)錄抑制eIF3j，在正常和氧化應(yīng)激條件下提高circ-β-TrCP的翻譯效率

曲妥珠單抗或過氧化氫治療增加了β-TrCP-343aa的水平，然而，circ-β-TrCP的表達(dá)沒有改變（圖5A-D），這表明circ-β-TrCP的翻譯是受氧化應(yīng)激調(diào)控的。但是在NRF2?/?細(xì)胞中，曲妥珠單抗或過氧化氫處理后，β-TrCP-343aa的表達(dá)保持不變（圖5E），這表明NRF2在氧化應(yīng)激條件下對β-TrCP-343aa的產(chǎn)生至關(guān)重要。敲低NRF2可降低β-TrCP-343aa的表達(dá)，但沒有降低circ-β-TrCP的表達(dá)（圖5 F-G），再次表明NRF2調(diào)控了β-TrCP-343aa的表達(dá)。此外，與野生型NRF2細(xì)胞相比，NRF2?/?細(xì)胞中eIF3j蛋白表達(dá)上調(diào)，NRF2過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)（圖5H）。同時過表達(dá)eIF3j可拮抗NRF2過表達(dá)升高的β-TRCP-343aa水平（圖5I），表明eIF3j參與了NRF2介導(dǎo)的β-TrCP-343aa的調(diào)控。此外，eIF3j的mRNA水平與其蛋白水平一樣，也受到NRF2的調(diào)控（圖5J）。

通過對編碼數(shù)據(jù)集的NRF2 ChIP-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)許多NRF2峰位于eIF3j的啟動子區(qū)域（圖5K）。此外，使用JASPAR在線工具，在eIF3j啟動子的?21 ~?11區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個ARE（圖5L）。然后對ARE進(jìn)行突變，并進(jìn)行熒光素酶報告基因檢測，結(jié)果顯示，敲低NRF2顯著增加了野生型eIF3j啟動子的活性，而對突變型1沒有影響（圖5M）。同樣，BT474-TR和SKBR3-TR細(xì)胞的細(xì)胞核提取物中的NRF2蛋白被野生型eIF3j啟動子探針富集，但突變探針不富集（圖5N）。接下來，作者設(shè)計了三對針對eIF3j啟動子中指定區(qū)域的引物（P1和P2為陰性對照組，P3含有ARE）（圖5L），然后ChIP檢測NRF2與eIF3j啟動子的結(jié)合。如圖5O所示，NRF2拉下的片段僅被P3擴(kuò)增。qRT-PCR結(jié)果顯示，NRF2在eIF3j啟動子中ARE基序上的富集量幾乎是IgG的4倍（圖5P）。此外，曲妥珠單抗治療顯著增加了NRF2在eIF3j啟動子上的富集（圖5Q-R）。在功能上，在NRF2?/?細(xì)胞中，過表達(dá)circ-β-TrCP并不影響曲妥珠單抗治療后的細(xì)胞活力（圖5S），而在曲妥珠單抗存在的情況下，circ-β-TrCP的過表達(dá)所引起的細(xì)胞活力和集落形成的增強(qiáng)在引入eIF3j后被顯著抑制（圖5T和U），表明circ-β-TrCP通過NRF2/eIF3j軸促進(jìn)曲妥珠單抗耐藥性。

綜上所述，NRF2通過轉(zhuǎn)錄抑制eIF3j來加速circ-β-TrCP的翻譯過程，從而在β-TrCP-343aa和NRF2之間形成一個正向調(diào)控環(huán)，加速曲妥珠單抗耐藥性。

總結(jié)：

circ-β-TrCP在曲妥珠單抗耐藥性中起著重要作用。對circ-β-TrCP表達(dá)的基因干預(yù)顯著改變了乳腺癌細(xì)胞對曲妥珠單抗的體內(nèi)外敏感性。進(jìn)一步的研究表明，circ-β-TrCP以NRF2依賴的方式有助于曲妥珠單抗的耐藥性。circ-β-TrCP編碼一種新的β-TrCP蛋白亞型，β-TrCP-343aa，與β-TrCP競爭，在細(xì)胞核中與NRF2結(jié)合，從而阻斷SCFβ-TrCP E3復(fù)合物介導(dǎo)的NRF2泛素化降解。此外，在正常條件或者氧化應(yīng)激條件下，eIF3j都會抑制circ-β-TrCP的翻譯，而NRF2能夠直接與eIF3j啟動子結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄，從而在β-TrCP-343aa和NRF2之間形成正循環(huán)，最終加速曲妥珠單抗的抗性。此研究為環(huán)狀RNA編碼功能在細(xì)胞生物學(xué)中的重要性提供了新的證據(jù)，也為HER2陽性乳腺癌患者對曲妥珠單抗耐藥的機(jī)制提供了新的見解。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.redox.2023.102896