“優(yōu)質(zhì)”的單細(xì)胞懸液是決定單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果的下限，也是單細(xì)胞測(cè)序高質(zhì)量數(shù)據(jù)的唯一相關(guān)因素，聽?wèi)T了“看得見”的碎片處理、細(xì)胞團(tuán)過濾、死細(xì)胞去除。今天來就由小歐來帶大家聽聽”看不見”的最危險(xiǎn)。

?單細(xì)胞懸液制備?

目前認(rèn)知下的制備單細(xì)胞懸液需要將組織置于37℃保溫，以便蛋白酶發(fā)揮作用。其主要缺陷在于，細(xì)胞在37℃下具有較高的代謝活性，解離過程將不可避免的引發(fā)大量應(yīng)激基因的高水平表達(dá)，造成細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的“人為誤差”和測(cè)序結(jié)果失真，無法真實(shí)反應(yīng)取材時(shí)細(xì)胞的“轉(zhuǎn)錄模式”，大大降低了結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[1]。

通過使用具有低溫解離活性的蛋白酶，已有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)37℃解離引起的偏差進(jìn)行了消除和減弱，取得了不錯(cuò)了效果，顯著提升了測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量。Adam等人通過使用具有低溫活性的蛋白酶，對(duì)小鼠腎臟組織進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，結(jié)果證明了在6℃條件下進(jìn)行解離，可以有效的消除、降低人為誤差[2]。這是由于在6℃及以下的溫度條件下，細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（transcriptional machinery）失去活性，無法產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。O’Flanagan等人隨后在腫瘤組織中進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明低溫解離能夠有效的降低應(yīng)激基因的表達(dá)，提高數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[3]。Denisenko等人進(jìn)一步比較了不同解離方法的差別，其中低溫解離能有效抑制因?yàn)槊附鈳淼霓D(zhuǎn)錄“偏好”（圖1）[4]。

以上文獻(xiàn)結(jié)果表明，采用低溫解離方案能夠有效的消除、降低由于37℃溫育帶來的“轉(zhuǎn)錄偏差”，提升數(shù)據(jù)質(zhì)量，增強(qiáng)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

?小歐的實(shí)驗(yàn)案列?

以小歐的動(dòng)物組織低溫解離實(shí)驗(yàn)為例，選取酶解位點(diǎn)遍布上皮、結(jié)締、肌、神經(jīng)組織的普適性最廣泛的地衣芽孢桿菌酶作為工具，在輔因子的幫助下，在4℃~6℃對(duì)組織中原代細(xì)胞進(jìn)行分離。下圖為具體實(shí)施例：

?心臟酶解實(shí)例(僅酶解)

?肺酶解實(shí)力(僅酶解)?

腎臟酶解實(shí)例(僅酶解)

如上展示，低溫解離技術(shù)可以拿到數(shù)量、活率毫不遜色于常溫酶解得到的原代細(xì)胞懸液。

經(jīng)過10+例人/鼠樣本測(cè)試，通過懸液優(yōu)化：

? ?1.篩網(wǎng)過濾 ：40μm細(xì)胞篩網(wǎng)除去細(xì)胞團(tuán)塊及碎片。

? ?2.碎片去除：密度梯度離心去除細(xì)胞碎片，根據(jù)細(xì)胞與雜質(zhì)比重差純化細(xì)胞。

? ?3.裂解紅細(xì)胞：對(duì)含有大量紅細(xì)胞的樣本，使用紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行紅細(xì)胞裂解。

? ?4.去除死細(xì)胞：磁珠法或流式細(xì)胞儀去除死細(xì)胞提高活細(xì)胞占比。

? ?5.緩沖液清洗：DPBS或其它不含鈣鎂離子，EDTA的緩沖液清洗細(xì)胞2~5次。

均能得到與常規(guī)解離無異的單細(xì)胞懸液結(jié)果，下圖為實(shí)施例展示。

心臟優(yōu)化實(shí)例

?肺優(yōu)化實(shí)例?

腎臟優(yōu)化實(shí)例

用低溫解離方案能夠復(fù)制出質(zhì)量與常規(guī)解離的單細(xì)胞懸液制備無異的結(jié)果。不僅如此還能避免那些“看不見”的危險(xiǎn)，提高數(shù)據(jù)質(zhì)量下限，有效的避免由于37℃溫育帶來的“轉(zhuǎn)錄偏差”，提升數(shù)據(jù)質(zhì)量，增強(qiáng)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為后期個(gè)性化分析保駕護(hù)航。

? 寫在最后?

細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本功能單位。不同類型細(xì)胞之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成了生命的基礎(chǔ)。研究對(duì)象的這一“基本屬性”決定了單細(xì)胞高通量技術(shù)是目前我們解析各種生命現(xiàn)象、揭示各種生物學(xué)機(jī)制的最強(qiáng)有力的技術(shù)手段。隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，原核細(xì)胞的scRNA-seq技術(shù)也將得到越來越多的應(yīng)用。這一領(lǐng)域的進(jìn)展必將為基礎(chǔ)研究以及臨床研究、乃至工程學(xué)應(yīng)用帶來全新的手段和方法，為我們攻克各種疾病提供新的技術(shù)，為人類健康與發(fā)展帶來福祉。

?歐易生物單細(xì)胞測(cè)序服務(wù)?

歐易生物是國內(nèi)最早開展單細(xì)胞測(cè)序分析的公司之一。目前擁有10x Genomics及BD Rhapsody兩個(gè)單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)，以及完整、系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析技術(shù)和流程。除了能夠進(jìn)行常規(guī)的scRNA-seq（single-cell RNA sequencing），還能夠進(jìn)行凍存樣本的snRNA-seq（single-nucleus RNA sequencing），為各種類型生物樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序提供了系統(tǒng)、完整的解決方案。竭誠為廣大制藥行業(yè)客戶提供高質(zhì)量的單細(xì)胞測(cè)序服務(wù)，助力您加快藥物研發(fā)進(jìn)程、降低臨床試驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)、節(jié)約研發(fā)成本。

公司成立十年來，本著為客戶提供優(yōu)質(zhì)且有溫度的高端技術(shù)服務(wù)這一核心理念，不斷開拓進(jìn)取，通過技術(shù)研發(fā)、流程優(yōu)化、精良設(shè)備引進(jìn)、優(yōu)秀人才聚集、持續(xù)管理提升，建立起了行業(yè)一流的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及嚴(yán)格的質(zhì)量管控體系，并始終秉承“硬數(shù)據(jù)，好服務(wù)”的一貫追求，為客戶提供優(yōu)質(zhì)的高端技術(shù)服務(wù)。

歡迎有意向開展單細(xì)胞測(cè)序研究的老師們向我們咨詢溝通單細(xì)胞相關(guān)問題?（技術(shù)熱線：021-34781616）

?參考文獻(xiàn)?

[1]Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 2017 Sep 29;14(10):935-936.

[2]Psychrophilic Proteases Dramatically Reduce Single-Cell RNA-seq Artifacts: A Molecular Atlas of Kidney Development. Development. 2017 Oct 1;144(19):3625-3632.

[3]Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.?Genome Biol. 2019 Oct 17;20(1):210.

[4]Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 2020 Jun 2;21(1):130.??

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心志盒子?? 撰文

本文系歐易生物原創(chuàng)

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