鱟試劑法是熱原檢查的重要經(jīng)典方法，與傳統(tǒng)的家兔法相比，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、成本低、操作簡便、易于掌握等特點(diǎn)，更便于基層檢驗(yàn)推廣使用。如何用鱟試劑法替代家兔法檢查熱原也因此成為人們比較關(guān)心的問題[1，2]。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法系利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素在一定條件下的反應(yīng)結(jié)果來判斷供試品是否符合規(guī)定的一種體外檢測方法。鱟試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確與否與所用鱟試劑的靈敏度標(biāo)示值相關(guān)性很大。所以，一定要嚴(yán)格執(zhí)行鱟試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，尤其是鱟試劑靈敏度的復(fù)核尤為重要[3]。鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)器具、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、檢查用水、實(shí)驗(yàn)環(huán)境、溫度、鱟試劑自身特性等因素的影響與制約，如果選擇或操作不當(dāng)，勢必會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。本文對導(dǎo)致鱟試劑靈敏度測試結(jié)果誤差的幾個(gè)常見因素予以分析，為鱟試驗(yàn)提供參考。

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1、鱟試劑自身質(zhì)量不合格

鱟試劑質(zhì)量體現(xiàn)在靈敏度、自凝時(shí)間與成膠狀態(tài)三個(gè)方面。

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1.1靈敏度

鱟試劑的標(biāo)示靈敏度即在藥典檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度[4]。隨存放時(shí)間、試驗(yàn)條件的不同，試劑在使用過程中的靈敏度也不盡相同。存放一定時(shí)間后(如半年)，質(zhì)量稍差的試劑其靈敏度可能發(fā)生變化，而靈敏度的改變會使測定結(jié)果所反映的供試品中內(nèi)毒素的允許限值發(fā)生變化。靈敏度偏低易產(chǎn)生“假陰性”，靈敏度偏高易產(chǎn)生”假陽性”。

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1.2自凝時(shí)間

自凝時(shí)間指用無熱原水或廠家所提供的內(nèi)毒素檢查用水將鱟試劑溶解，（37±1）℃放置后產(chǎn)生凝集所需的時(shí)間。24h不凝集的為質(zhì)量優(yōu)者，自凝時(shí)間不低于4h者為合格[5]。因?yàn)橘|(zhì)量較優(yōu)的鱟試劑本身不含內(nèi)毒素或即使含有內(nèi)毒素，其量也較少，不足以促發(fā)鱟試驗(yàn)生化反應(yīng)。質(zhì)量較差的鱟試劑自凝時(shí)間短，是因?yàn)樵噭┍旧砘煊邢喈?dāng)量的內(nèi)毒素，這種鱟試劑是不能使用的。

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1.3成膠狀態(tài)

成膠狀態(tài)即鱟試驗(yàn)反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)產(chǎn)生的凝膠狀態(tài)。質(zhì)量優(yōu)者反應(yīng)前具良好的流動性，反應(yīng)后即形成堅(jiān)實(shí)凝膠，將成膠安瓿翻轉(zhuǎn)180度而不會被破壞。質(zhì)量劣者，反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)生成的凝膠不牢固，易滑脫、破壞，有的甚至于反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)不能成膠。

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為防止因選擇、購買不當(dāng)而引起的檢驗(yàn)誤差，一方面，購入時(shí)要選擇質(zhì)量較穩(wěn)定的鱟試劑，要求必須具有國家頒發(fā)的批準(zhǔn)文號，一批新試劑應(yīng)復(fù)核其靈敏度；對留樣鱟試劑自生產(chǎn)之日起，每6個(gè)月進(jìn)行一次靈敏度檢測，其靈敏度18個(gè)月內(nèi)應(yīng)符合規(guī)定[6]；鱟試劑不應(yīng)產(chǎn)生自身凝集作用，應(yīng)具有一定的緩沖能力與合適的pH。我國現(xiàn)用的鱟試劑為鱟科動物東方鱟的血液變形細(xì)胞溶解物的無菌冷凍干燥品，本品含能被微量細(xì)菌內(nèi)毒素激活的凝固酶原、凝固蛋白原，其靈敏度以細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品或工作標(biāo)準(zhǔn)品測定，應(yīng)為標(biāo)示量的50%~200%[4]；另一方面，要適量購買，防止積壓；貯藏要避光，嚴(yán)格控制溫、濕度，避免防止因選購、貯藏不當(dāng)、質(zhì)量下降而引起的檢驗(yàn)誤差。

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2、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品本身效價(jià)不準(zhǔn)確

鱟試劑靈敏度檢測中細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)亦是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素。因此，選擇合格的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品是必不可少的。細(xì)菌內(nèi)毒素的化學(xué)成分是脂多糖的復(fù)合體，即脂多糖(LPS)是由O-特異性鏈-核心多糖-類脂A三部分組成，其中類脂A的酰氨鍵是構(gòu)成不穩(wěn)定的重要因素之一。故細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品在運(yùn)輸或保管時(shí)易受氣溫影響而使效價(jià)衰減。為避免試驗(yàn)結(jié)果的錯(cuò)判，標(biāo)準(zhǔn)品的獲得除應(yīng)必須是由中國藥品生物制品檢定所統(tǒng)一發(fā)放外，對標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)復(fù)核亦為重要。

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細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品

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細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)的測定方法如下:取4支樣品(待標(biāo))及一支國家標(biāo)準(zhǔn)品，使用同一批號鱟試劑，每支樣品按重量，標(biāo)準(zhǔn)品按單位，分別用內(nèi)毒素檢查用水稀釋制備一系列2倍稀釋度的內(nèi)毒素溶液，與鱟試劑反應(yīng)。當(dāng)4支樣品的反應(yīng)終點(diǎn)的對數(shù)平均值的標(biāo)準(zhǔn)差小于0.365時(shí)，計(jì)算4支樣品反應(yīng)終點(diǎn)的幾何平均值(∑logC/ n，以ng·ml-1表示)及標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)終點(diǎn)值(以EU·ml-1表示)，按下式計(jì)算樣品的效價(jià):

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3、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)低

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水主要進(jìn)行所用鱟試劑的溶解以及細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，是實(shí)驗(yàn)過程中極為重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)低會直接影響鱟試劑的檢測結(jié)果。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水是一種特殊的水，它不僅要求有嚴(yán)格的 pH（6.8 ~8.2），而且其內(nèi)毒素含量必須小于0.015EU·ml-1，與鱟試劑在（37±1）℃條件下 24 h不產(chǎn)生凝集反應(yīng)[4]。它不同于注射用水，不能用于代替使用。如有些生產(chǎn)單位或醫(yī)療單位生產(chǎn)注射用水，經(jīng)過嚴(yán)格檢查達(dá)不到現(xiàn)行版藥典要求，這類注射用水是不可以使用的。因此，我們現(xiàn)用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水主要由鱟試劑生產(chǎn)廠家提供，質(zhì)量較穩(wěn)定。

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細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水

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4、實(shí)驗(yàn)器具不潔凈

玻璃試驗(yàn)管、稀釋管﹑刻度管、鋁蓋盒等實(shí)驗(yàn)用具洗滌不徹底，也會影響下次的檢驗(yàn)結(jié)果，使實(shí)驗(yàn)失敗或造成誤差。因此，每次檢驗(yàn)完畢，玻璃器皿應(yīng)及時(shí)用鉻酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗液充分浸泡，然后取出將洗液空干，用自來水將殘留洗液徹底洗凈，再用蒸餾水反復(fù)沖洗3遍以上，控干后放入適宜的密閉容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器內(nèi)，放置入烤箱，250℃以上干熱滅菌處理(待烤箱溫度升至設(shè)定的溫度后開始記時(shí))[4]，也可用其他適宜的方法，并確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查，試驗(yàn)操作過程應(yīng)防止微生物的污染。塑料、橡膠等不耐熱器材可用30%雙氧水浸泡4h，用無熱原水沖洗，70℃干燥備用。

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5、操作方法不當(dāng)

選擇合適的操作方法與順序，對鱟試劑靈敏度檢測尤為重要。在操作過程中以下幾點(diǎn)值得注意：

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①鱟試劑溶解和配制時(shí)應(yīng)盡量避免將安瓿外瓶壁臟物、瓶壁碎片、砂輪鋸屑等異物混入鱟試劑中，避免鱟試劑外損。

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②鱟試劑中含有多種蛋白質(zhì)，用力振搖會產(chǎn)生氣泡，一旦起泡難以消除，既而影響檢測的準(zhǔn)確性，所以在整個(gè)操作過程中都要避免因震動而引起的誤差。

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③標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的配制和稀釋時(shí)，采用材質(zhì)好而光潔的玻璃器皿作為內(nèi)毒素稀釋管，各稀釋管吸取內(nèi)毒素稀釋液時(shí)要充分搖勻，以稀釋液洗吸管，避免吸附內(nèi)毒素。

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④反應(yīng)物的量取和加樣時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素液和樣品液一定要加到試管底部接近鱟試液而不接觸鱟試液的管壁處，樣品加入后立即輕輕搖勻。

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⑤活化物質(zhì)的影響：有的廠家生產(chǎn)的鱟試劑中未加活化物質(zhì)，而加在溶解液中，故最好以配套的溶解液來溶解鱟試劑。

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⑥pH的影響：生成凝膠的最適pH為6 ~8，對于氯化鈉注射液、葡萄糖注射液(5%，10%)等液體，由于鱟試劑本身的緩沖作用，可以不考慮供試液的pH，而檢查其他制劑時(shí)，應(yīng)考慮供試品的pH，尤其是一些本身緩沖能力較強(qiáng)或偏酸、堿的供試品。

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6、操作溫度與操作時(shí)間的影響

實(shí)驗(yàn)室溫度和恒溫水浴箱的溫度，都是不容忽視的因素。37℃并不是最高反應(yīng)溫度，反應(yīng)溫度越高，反應(yīng)速度越大。即使在室溫下操作，內(nèi)毒素和樣品混合液不待進(jìn)入37℃恒溫反應(yīng)器內(nèi)反應(yīng)已告開始，這樣操作誤差較大。操作溫度較低，試管外壁易結(jié)露，同樣會引起測定誤差。因此，在鱟試驗(yàn)中要重視溫度的變化，同時(shí)應(yīng)注意保溫時(shí)間，尤其夏天室溫較高時(shí)，加樣在冰水浴中進(jìn)行可取得較好效果。

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另外，進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)室要求潔凈、無塵埃流通；操作者應(yīng)以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，以確保檢測結(jié)果真實(shí)可信。

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參考文獻(xiàn)

1潘東揚(yáng)，湯秋華.燈盞細(xì)辛注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的探討[J]，中國藥師，2006，9（9）:837-838

2薛瑾，劉浩，呂懷哲，等.注射用鹽酸頭孢吡肟細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[J].中國藥師，2006，9（9）:864-866

3中國藥典[S].2005年版.二部.附錄85-88

4中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2005. 287-297

5中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范[S].200年版.附錄62-63

6中華人民共和國衛(wèi)生部.部標(biāo)準(zhǔn)《鱟試劑》修訂稿[S].WS1-364（B-123）-91

( 2006-09-19收稿2006-12-13修回)

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本文作者：張紅霞?陳慧?馬金剛，文章來源：China Pharmacist 如有侵權(quán)，請聯(lián)系刪除，謝謝。