01研究背景

鐵死亡是一種鐵依賴性調(diào)節(jié)細胞死亡形式，由細胞膜脂質(zhì)過氧化物的過載引起。近年來，鐵死亡引發(fā)關(guān)注并大量報道。本研究通過擬靶向脂質(zhì)組學、免疫組學等方法，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)腫瘤細胞鐵死亡，可作為一種潛在的治療方法。但是否通過多種途徑從不同維度進行調(diào)節(jié)仍需深入探索，鐵死亡概念的提出與機制深入探究，為進一步發(fā)掘腫瘤靶向治療提供新方向。

02前言

2023年5月，復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院胸外科王群、詹成課題組與美國德克薩斯大學MD安德森癌癥中心Boyi Gan課題組在Cancer Research期刊發(fā)表的題為 “Retinol saturase mediates retinoid metabolism to impair a ferroptosis defense system in cancer cells ”（IF：13.312）的研究成果，通過靶向代謝組學、qRT-PCR?、LC-MS、免疫組織化學等研究方法，發(fā)現(xiàn)類視黃醇顯著抑制鐵死亡能力特征，腫瘤靶向治療提供了理論依據(jù)。

03研究思路

04研究方法

研究材料：

雄性BALB/c裸鼠，4周齡，隨機分為六個治療組（n=8）

研究技術(shù)：

（1）CCK8：測定細胞活力

（2）qRT-PCR：RNA提取和定量分析

（3）免疫印跡：檢測蛋白質(zhì)

（4）BODIPY-C11法：測定脂質(zhì)過氧化

（5）MDA測定：MDA試劑盒

（6）FENIX測定：Malvern粒度儀

（7）RNA測序：Illumina HiSeq平臺

（8）LC-MS：靶向脂質(zhì)組學分析

（9）染色質(zhì)免疫沉淀法CHIP：測定染色質(zhì)

（10）免疫組織化學：分析腫瘤體

05研究結(jié)果

1.?CRISPR/Cas9篩選發(fā)現(xiàn)RETSAT是一種重要的鐵死亡疾病介體

通過CRISPR/Cas9篩選發(fā)現(xiàn)，除了LA（亞油酸）外所有的脂肪酸中，ACSL4參與PUFAs（多不飽和脂肪酸）酯化的鐵死亡因子調(diào)節(jié)。研究通過細胞實驗進一步發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞中敲低或敲除RETSAT對鐵死亡誘導(dǎo)的RSL3、IKE等導(dǎo)致的細胞脂質(zhì)過氧化及后續(xù)細胞死亡具有顯著的保護作用。表明FINs（鐵死亡誘導(dǎo)劑）誘導(dǎo)RETSAT上調(diào)，RETSAT參與了鐵死亡級聯(lián)反應(yīng)（圖1A-E）。

2.?RETSAT是一種不干擾已知鐵死亡調(diào)節(jié)因子的促鐵死亡基因

研究發(fā)現(xiàn)RETSAT-KO細胞作用不同靶點的多種FINs觸發(fā)的鐵死亡性貧血更具抵抗力。RETSAT-KO細胞對FINs的敏感性通過重新表達而恢復(fù)，而排除了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的RETSAT耗竭的脫靶效應(yīng)。RETSAT在鐵蛋白血癥中顯示出特異性，RETSAT-KO阻止了RSL3誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化，表明RETSAT是一個關(guān)鍵促鐵死亡基因（圖1F-K）。

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圖1 CRISPR/Cas9篩查將RETSAT與鐵死亡性貧血相關(guān)聯(lián)

3.?類視黃醇可防止脂質(zhì)過氧化和鐵死亡性貧血

RETSAT鐵死亡性貧血和類視黃醇代謝作用，通過外源性培養(yǎng)補充ROL(視黃醇)及下游代謝產(chǎn)物，包括RAL（視黃醛）和RA（視黃酸），以劑量依賴的方式消除細胞對FINs的敏感性。ROL、RAL和RA顯著消除了由RSL3引起的脂質(zhì)過氧化（圖2A-C）。

4.?STRA6通過介導(dǎo)ROL進入細胞防止鐵死亡性貧血

通過CRISPR/Cas9產(chǎn)生的STRA6-KO細胞系發(fā)現(xiàn)STRA6的缺失不僅使細胞對FINs敏感，且削弱了外源性補充的ROL抗鐵死亡作用。表明類視黃醇在預(yù)防鐵死亡性貧血引起了脂質(zhì)過氧化（圖2D-F）。

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圖2視黃醇作為自由基捕獲預(yù)防鐵死亡性貧血抗氧化劑

5.?類視黃醇是有效的自由基捕獲抗氧化劑

研究通過熒光抑制自氧化（FENIX）測定模擬細胞膜的脂質(zhì)雙層。ROL、RAL或RA，以劑量依賴方式顯著延遲了自身氧化。代謝產(chǎn)物中，RAL表現(xiàn)出最強的自由基捕獲活性，可能是具有獨特的官能團。表明類視黃醇可以捕獲脂質(zhì)雙層中的自由基，而破壞脂質(zhì)過氧化（圖3A-C）。

6.?RETSAT通過介導(dǎo)ROL減少13,14-DROL促進鐵死亡性貧血

研究發(fā)現(xiàn)RETSAT的酶促功能將ROL轉(zhuǎn)化為13,14-DROL，具有與RETSAT一致的促鐵死亡作用。用ROL補充的Cas-NC、RETSAT-KO和RETSAT-OE細胞，可降低或消除對FINs的敏感性。表明RETSAT通過酶促介導(dǎo)將ROL轉(zhuǎn)化為13,14-DROL，從而削弱了ROL的抗氧化活性（圖3D）。

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圖3 RETSAT通過介導(dǎo)類視黃醇代謝調(diào)節(jié)鐵死亡性貧血

7.?RETSAT部分通過視黃酸受體途徑發(fā)揮其促鐵死亡作用

研究發(fā)現(xiàn)RETSAT的缺失顯著激活了RAR（視黃酸受體）信號通路。RAR顯著降低細胞的脂質(zhì)過氧化和鐵死亡細胞的敏感性，而RAR拮抗劑則不能，因為細胞系中的基礎(chǔ)RAR激活水平較低。通過外源性補充RAR激動劑來提高RAR活性，揭示了載體和細胞間鐵死亡敏感性差異。RETSAT通過消除類視黃醇的自由基捕獲特性和抑制RAR途徑調(diào)節(jié)鐵死亡性貧血，而RAR激動劑和拮抗劑只能部分消除RETSAT的影響（圖4）。

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圖4 RETSAT部分通過視黃酸受體途徑促進鐵死亡性貧血

8.?擬靶向脂質(zhì)組學顯示RETSAT的耗竭可促進單不飽和脂肪酸的生成

靶向脂質(zhì)組學發(fā)現(xiàn)在攜帶RETSAT-KO的A549細胞中脂肪酸和磷脂顯著增加。脂質(zhì)組學研究結(jié)果與RETSAT-KO細胞系對脫鐵性貧血的耐藥性增加一致，說明RETSAT-RAR通路通過促進單不飽和脂肪酸（或酰基）（MUFA）的產(chǎn)生介導(dǎo)鐵死亡性貧血（圖5A-C）。

9.?RETSAT-RAR通路通過SCD介導(dǎo)的MUFA使細胞對鐵死亡性貧血敏感

通過靶向脂質(zhì)組學發(fā)現(xiàn)RETSAT-KO和RAR的激活誘導(dǎo)了SCD的表達和MUFA的產(chǎn)生。RARα結(jié)合位點（RARE）、RETSAT耗竭及RAR激動劑激活轉(zhuǎn)錄，證實RAR通過與其啟動子結(jié)合直接激活SCD轉(zhuǎn)錄。RETSAT抑制RAR信號通路的活性，延緩RAR靶向SCD的轉(zhuǎn)錄，而導(dǎo)致MUFA生成減少（圖5D-P）。

?圖5 RETSAT-RAR通路通過SCD介導(dǎo)的MUFA生成促進鐵死亡性貧血

10.?體內(nèi)類視黃醇代謝改變腫瘤鐵下垂

通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，RETSAT缺失沒有顯著抑制或促進腫瘤的生長。在腫瘤樣本中，RETSAT缺失和類視黃醇補充均減輕了脂質(zhì)過氧化標記物。研究結(jié)果證實，RETSAT-KO或外源性補充劑引起的類視黃醇水平升高使體內(nèi)腫瘤對鐵下垂脫敏，并提高了腫瘤治療中靶向類視黃醇代謝的可能性（圖6A-B）。

11.?類視黃醇代謝與LUAD患者預(yù)后的關(guān)系

通過類視黃醇臨床相關(guān)研究，LUAD（肺腺癌）患者中較低的RETSAT表達水平與較短的總生存期相關(guān)，而STRA相反。免疫組化分析了具有臨床病理特征的LUAD患者中RETSAT和STRA6的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)RETSAT在正常肺組織中大量表達，但在LUAD組織中弱表達，而STRA6呈現(xiàn)相反的趨勢。研究結(jié)果表明，腫瘤細胞中類視黃醇的合成增強產(chǎn)生過量的ROS，導(dǎo)致了惡性腫瘤的增加（圖6C-H）。

圖6視黃醇代謝改變體內(nèi)腫瘤鐵死亡性貧血并與LUAD患者預(yù)后相關(guān)

06研究結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)類視黃醇對鐵死亡的調(diào)控作用與脂質(zhì)代謝有關(guān)。類視黃醇類物質(zhì)具有抗氧化能力，可防止脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致的細胞膜碎裂，從而終止鐵死亡。通過擬靶向脂質(zhì)組學等研究發(fā)現(xiàn)，類視黃醇還可促進單不飽和脂肪酸的生成。而體內(nèi)類視黃醇代謝可改變腫瘤鐵下垂，并與LUAD患者預(yù)后相關(guān)。

本研究通過靶向代謝組學、免疫組學等方法揭示了類視黃醇拮抗腫瘤細胞鐵死亡機制。這一發(fā)現(xiàn)有助于探尋靶向腫瘤細胞視黃醇代謝誘導(dǎo)腫瘤細胞鐵死亡的治療方案，為進一步探索腫瘤靶向治療提供的新方法、新思路。

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