摘要

以往的研究報道，較短的平均端粒長度的淋巴細(xì)胞與增加易感性的常見疾病的老齡化，并可能預(yù)測癌癥的風(fēng)險。然而，大多數(shù)分析都檢查了回顧性收集的病例對照研究。

平均端粒長度采用高通量實(shí)時熒光定量 PCR 測定。在東盎格魯 SEARCH 乳腺癌(2243例，2181例對照)和 SEARCH 結(jié)直腸癌(2249例，2161例對照)研究的癌癥診斷后收集用于 DNA 提取的血液。前瞻性病例對照研究進(jìn)行了乳腺癌(199例)和大腸癌(185例) ，嵌套在 EPIC-諾?？岁?duì)列。在診斷前至少6個月采集血液，并與每個病例的兩個無癌對照組的 DNA 進(jìn)行匹配。

在回顧性研究中，SEARCH研究中，平均端粒長度最短(Q4)與最長(Q1)四分位數(shù)的年齡調(diào)整優(yōu)勢比為15.5(95% CI 11.6-20.8) ，p-het = 5.7 × 10-75; “每四分位數(shù)”p 趨勢 = 2.1 × 10.80為乳腺癌，2.14(95% CI 1.77-2.59) ，p-het = 7.3 × 10-15; “每四分位數(shù)”p 趨勢 = 1.8 × 10-13為大腸癌。在 EPIC 的前瞻性研究中，可比的優(yōu)勢比[ Q4對 Q1]為1.58(95% CI 0.75-3.31) ，p-het = 0.23為乳腺癌，1.13(95% CI 0.54-2.36) ，p-het = 0.75為大腸癌風(fēng)險。

平均端粒長度在回顧性收集的病例中比對照組短，但在前瞻性研究中相當(dāng)?shù)年P(guān)聯(lián)明顯較弱。這表明端?？s短主要發(fā)生在診斷后，因此可能不具有預(yù)測癌癥的價值。

引言

人類染色體被端粒覆蓋并穩(wěn)定，端粒主要由幾千個(TTAGGG) n 重復(fù)(1-3)形成，長度異質(zhì)，在染色體和個體之間變化(4-8)。端粒防止染色體末端被識別為需要雙鏈斷裂修復(fù)的受損 DNA，從而防止染色體融合和重排，幫助保持基因組的完整性(9-12)。

端粒 DNA 復(fù)制效率低下。這被稱為“末端復(fù)制問題”(1,13,14) ，導(dǎo)致平均端粒長度逐漸減少，估計為每年15-60bp (15,16) ，這一速率在50歲以上增加(5,17)。有報告指出，環(huán)境因素如吸煙(18-20歲)、氧化應(yīng)激(21-23歲)、身體健康欠佳(24-26歲)和肥胖(18歲)可能會加速端粒損耗。因此，平均端粒長度被認(rèn)為是衡量細(xì)胞和生物體“生物學(xué)年齡”的標(biāo)準(zhǔn)(27,28)。

先前的實(shí)驗(yàn)研究表明，端粒平均長度相對較短的個體可能會增加死于多種疾病的風(fēng)險(20,29-38)。特別是，五項(xiàng)研究已經(jīng)調(diào)查了乳腺癌風(fēng)險與平均端粒長度之間的關(guān)系(35-39)。Shen 等[35]報道，端粒長度較短(287例，350例姐妹對照)的乳腺癌風(fēng)險增加，臨界統(tǒng)計學(xué)顯著性增加; 優(yōu)勢比[最短 Q4與最長 Q1(參考)] = 1.55(95% 置信區(qū)間0.88-2.73) ，p = 0.14。來自同一組的第二項(xiàng)更大的研究(36)報道了50歲以下女性乳腺癌風(fēng)險的顯著相關(guān)性; OR [ Q4 vs. Q1] = 1.78(95% CI 1.15-2.76) ，p = 0.01。50歲以上女性的平均端粒長度與乳腺癌無關(guān)(36)。在這兩項(xiàng)研究中，回顧性地收集病例個體的血液樣本進(jìn)行 DNA 提取——在癌癥診斷之后。

到目前為止，已經(jīng)發(fā)表了兩篇關(guān)于平均端粒長度和大腸癌之間關(guān)系的研究(40,41)。在男性(191例，306例對照)和女性(134例，357例對照)中進(jìn)行的這些前瞻性嵌套病例對照比較顯示，端粒長度與疾病狀態(tài)之間沒有關(guān)聯(lián)。

在這里，我們測量了前瞻性和回顧性收集的乳腺癌和大腸癌病例對照系列的平均端粒長度，以更精確地評估端粒長度與癌癥狀態(tài)之間的關(guān)系，并測試平均端粒長度是否對癌癥易感性具有預(yù)測價值。

材料與方法

回顧性SEARCH 乳腺癌病例對照研究

SEARCH 乳腺研究(42)是一項(xiàng)正在進(jìn)行的基于人群的研究，通過東部癌癥登記和信息中心(ECRIC， http://www.ECRIC.org.uk/)確定病例，該中心是一個覆蓋劍橋郡、諾福克、薩?？?、貝德福德郡、赫特福德郡和埃塞克斯縣的基于人群的癌癥登記處。自1996年以來確診的70歲以下婦女(事件個案，中位年齡55歲)有資格納入。大約64% 符合條件的患者參加了這項(xiàng)研究。研究參與者被要求提供20毫升血液樣本進(jìn)行 DNA 分析，并完成一份全面的流行病學(xué)調(diào)查問卷。沒有參加研究的符合條件的患者與參與者相似，只是非參與者中臨床 III/IV 期病例的比例稍高。

在本報告中，我們使用了最近累積的、提取的和標(biāo)準(zhǔn)化的 DNA 樣本，包括2004年至2007年間診斷的2243例事件病例和2181例對照。大多數(shù)(n = 1524)對照被收集作為 SEARCH 研究中的無癌史對照參與者，在2003年至2007年期間招募。其余的(n = 657)是從 EPIC (歐洲癌癥前瞻性調(diào)查)的諾福克部分選擇的無癌女性。對照在年齡上與病例大致相似(SEARCH 對照的中位年齡為53歲，EPIC 對照的中位年齡為54歲) ，SEARCH 對照另外與 SEARCH 病例的居住地區(qū)和年齡組頻率相匹配。

前瞻性 EPIC 乳腺癌和結(jié)直腸癌病例對照研究

病例和對照樣本來自歐洲癌癥前瞻性調(diào)查(EPIC)的諾?？岁?duì)列(http://www.srl.cam.ac.uk/EPIC/)。EPIC 是一項(xiàng)正在歐洲九個國家進(jìn)行的關(guān)于飲食和癌癥的前瞻性研究。EPIC-諾福克隊(duì)列包括超過30,000人，年齡在45-75歲之間，居住在東安格利亞的諾?？?，并在1993年至1997年期間從全科醫(yī)生注冊處招募。這是一個種族同質(zhì)的人口，99% 以上被報道為歐洲白人。共有25,639名參與者完成了初步健康檢查。1998年1月，該隊(duì)列被邀請進(jìn)行第二次健康檢查，15,786人參加了第二階段的檢查。所有參與者均表示知情同意，并與東盎格魯癌癥登記處和聯(lián)合王國國家統(tǒng)計局登記處進(jìn)行比對。這些提供了整個隊(duì)列的所有癌癥登記、死亡和移民的通知，因此，失訪率 < 0.1% 。

這項(xiàng)分析的合格病例是研究參與者，他們在基線評估中沒有癌癥，并且在抽血后至少六個月和直到2003年12月底被診斷出患有乳腺癌或大腸癌。全部數(shù)據(jù)分別用于199例和185例乳腺癌和大腸癌的端粒長度分析。符合條件的對照是研究參與者誰仍然沒有癌癥在這段時間。兩個對照組按性別、年齡(一年內(nèi))和抽血日期(三個月內(nèi))對每個病例進(jìn)行匹配?？偣灿?84例乳房或大腸癌事件和826例匹配的對照參與者可供分析。從采血到確診的平均時間為3.3年(范圍為1.4至4.6年)。進(jìn)一步的研究特征見補(bǔ)充表1b。

Real Time PCR?

通過 SYBR Green Real Time PCR 測量端粒重復(fù)單位(TEL)與單拷貝基因(CON)的比率(TEL/CON)(20,43)確定相對平均端粒長度。TEL 測定法擴(kuò)增78bp 端粒重復(fù)單位，并且檢測到的熒光與可用于引物結(jié)合的基因組中的端粒重復(fù)數(shù)量成比例，因此與提取 DNA 的細(xì)胞中的平均端粒長度成比例。CON 分析擴(kuò)增了單拷貝人 β-珠蛋白基因序列的一個片段，并用于校正加入到反應(yīng)中的模板 DNA 的樣品到樣品的變異。

結(jié)果

質(zhì)控

作為在三個病例對照系列中測定質(zhì)量保證的措施，計算了在不同 PCR 批次中測定的相同樣品的重復(fù)測量之間的相關(guān)性。在每項(xiàng)研究中，ΔCt 值≥0.83(CON PCR ≥0.92，TEL PCR ≥0.93)。超過97% 的試驗(yàn)樣本給出了結(jié)果。對于 ΔCt 值，一式三份“檢驗(yàn)”平板測定中的 Spearman 秩次相關(guān)性≥0.71(CON PCR ≥0.72，TEL PCR ≥0.87)。作為進(jìn)一步驗(yàn)證所使用的測定，已知的平均端粒長度與年齡在未受影響的對照研究樣本集(n = 5256)進(jìn)行了檢查。正如預(yù)期的那樣，平均端粒長度隨著年齡而顯著降低(調(diào)整研究，性別和384孔板后) ; ΔCt‘ per year’= 0.0045(95% CI 0.003-0.006) ，p 趨勢 = 1.5 × 10-9。

平均端粒長度與乳腺癌

回顧性和前瞻性乳腺癌研究中按四分位數(shù) ΔCt 調(diào)整的估計優(yōu)勢比(年齡和平板)如表1所示。與前瞻性研究相比，回顧性研究觀察到更強(qiáng)的相關(guān)性。在回顧性研究中，端粒長度四分位數(shù)呈下降趨勢，“每四分位數(shù)”，平板和年齡調(diào)整 OR = 2.56(95% CI 2.32.5.23) ，p 趨勢 = 2.1 × 10-80。ΔCt 最短(Q4)與最長(Q1)四分位數(shù)的比值比為15.5(95% CI 11.6-20.8) ，p-het = 5.7 × 10-75。盡管病例與本研究中來自兩個不同來源的對照匹配，但與 SEARCH 對照匹配的患者[ OR‘每四分位數(shù)’= 2.44(95% CI 2.21-2.70) ，p 趨勢 = 8.5 × 10-69]和匹配的患者通過 EPIC-Norfolk [2.18(95% CI 1.90-2.51) ，p 趨勢 = 2.5 × 10-28]確定的對照。在50歲以下或50歲以上的受試者中，效應(yīng)量沒有顯著差異，這是一個接近絕經(jīng)前和絕經(jīng)后狀態(tài)的分類(數(shù)據(jù)未顯示)。

對于每項(xiàng)研究，病例和對照中 ΔCt 的分布在補(bǔ)充圖1中進(jìn)一步說明。在所有四個小組中，病例分布偏向?qū)φ辗植嫉挠覀?cè)，但這在回顧性乳腺癌研究(左下)中最為顯著，其中幾乎一半的病例(2243例中的45% -1013例)位于最短的四分位數(shù)長度，Q4。

在前瞻性乳腺癌研究中，與 ΔCt 的關(guān)聯(lián)與回顧性乳腺癌研究方向相同，但幅度小得多，無統(tǒng)計學(xué)意義。

平均端粒長度和大腸癌

大腸癌病例對照結(jié)果與乳腺癌研究的結(jié)果類似，盡管風(fēng)險評估點(diǎn)較小(表2)。在回顧性結(jié)直腸研究中，平板和年齡調(diào)整的 OR‘每四分位數(shù)’= 1.25(95% CI 1.18-1.33) ，p 趨勢 = 1.18 × 10-13; OR [ Q4 vs. Q1] = 2.14(95% CI 1.77-2.59) ，p-het = 7.3 × 10-15。在前瞻性大腸癌研究中沒有證據(jù)表明兩者之間存在聯(lián)系。

討論

我們采用定量 PCR 方法(20,43)來評估大規(guī)模流行病學(xué)研究中淋巴細(xì)胞的端粒長度。我們已經(jīng)證明這種方法在多重重復(fù)測定中是可重復(fù)的，并且顯示了已知隨著年齡的增長而發(fā)生的端粒長度的預(yù)期縮短。

在回顧性研究中，我們發(fā)現(xiàn)較短的端粒長度與乳腺癌狀態(tài)之間有很強(qiáng)的相關(guān)性，與頂部四分位數(shù)相比，端粒長度最低四分位數(shù)的女性的 OR 值約為15。

前瞻性乳腺癌研究顯示，一些證據(jù)表明在同一方向的聯(lián)系，但效果沒有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，淋巴細(xì)胞平均端粒長度是癌癥風(fēng)險預(yù)測因子的假說似乎被夸大了。除了一項(xiàng)之前發(fā)表的關(guān)于乳腺癌與平均端粒長度之間關(guān)系的研究外，其他所有研究都顯示了與我們在這里報道的相同方向的關(guān)聯(lián)。然而，大多數(shù)這些研究的效應(yīng)大小與前瞻性研究相似，盡管這些研究主要是回顧性的。唯一一項(xiàng)關(guān)于乳腺癌風(fēng)險和平均端粒長度的真正前瞻性研究(39)給出了與我們相似的風(fēng)險估計; OR (39)[‘低于’和‘高于’中位長度] = 1.23(95% CI 0.94-1.60) ，p 趨勢 = 0.20 vs. OR = 1.52(95% CI 0.90.2.58) ，p-het = 0.12。

可能是前瞻性研究的結(jié)果低估了任何關(guān)聯(lián)的真實(shí)大小，這可能是由于這些研究的規(guī)模相對較小，或者僅僅是隨機(jī)測量誤差。研究規(guī)模不太可能導(dǎo)致我們忽略了搜索回顧性研究規(guī)模的真正關(guān)聯(lián)。在我們的乳腺癌研究中，前瞻性和回顧性研究的置信區(qū)間幾乎沒有重疊，De Vivo 等(39)發(fā)表的研究顯示使用兩倍于我們的研究的相似點(diǎn)估計和置信區(qū)間。

我們在實(shí)質(zhì)性回顧性乳腺癌研究中看到的影響比以前的報道大得多。統(tǒng)計學(xué)顯著性的水平可能部分是由于研究規(guī)模的增加，但是大的比率提高了這種關(guān)聯(lián)可能是人為的可能性，這是由于回顧性收集的研究容易出現(xiàn)的 DNA 收集，儲存，質(zhì)量或其他偏倚的差異。這種實(shí)時 PCR 檢測非常依賴于均勻的 DNA 質(zhì)量。然而，我們發(fā)現(xiàn)從不同來源獲得的對照之間的平均端粒長度幾乎沒有差異。此外，我們假設(shè) DNA 提取率與回顧性樣品的 ΔCt 值之間沒有相關(guān)性，這可能與 DNA 質(zhì)量有關(guān)。當(dāng)使用原始的整個研究 ΔCt 邊界進(jìn)行四分位數(shù)計算時，或當(dāng) ΔCt 的四分位數(shù)在逐板基礎(chǔ)上重新計算時，沒有明顯的板偏倚(補(bǔ)充圖2).然而，從補(bǔ)充圖1中沿 x 軸的 ΔCt 值可以明顯看出。不同實(shí)驗(yàn)的范圍是不同的(注: 兩個前瞻性研究在同一個實(shí)驗(yàn)中一起測定)。值得注意的是，從一個實(shí)驗(yàn)到另一個實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的平均端粒長度是相對于該實(shí)驗(yàn)的，而不是絕對的。它們可以根據(jù) PCR 效力和試劑批次而變化，但這些因素對等級或四分位數(shù)分配的影響很小。

參考

Pooley KA, Sandhu MS, Tyrer J, Shah M, Driver KE, Luben RN, Bingham SA, Ponder BA, Pharoah PD, Khaw KT, Easton DF, Dunning AM. Telomere length in prospective and retrospective cancer case-control studies. Cancer Res. 2010 Apr 15;70(8):3170-6. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-09-4595. PMID: 20395204; PMCID: PMC2855947.