以HCEC-B4G12人角膜內(nèi)皮細(xì)胞為例：

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培養(yǎng)方法

培養(yǎng)條件：Human-Endothelial-SFM，10ng/mL FGF-2b（bFGF）

傳代方法：1:3傳代；消化2-3分鐘。

倍增時(shí)間：40-50 hours （DSMZ）

凍存液配方：完全培養(yǎng)基+10%?DMSO

培養(yǎng)難點(diǎn)：部分細(xì)胞存在空泡，屬于細(xì)胞正常特性

注意事項(xiàng)

1)?使用配套無(wú)血清培養(yǎng)基Human-Endothelial-SFM培養(yǎng)，注意效期。

2)?消化條件：無(wú)鈣、鎂離子的PBS清洗細(xì)胞后，使用0.25%胰酶+EDTA消化，具體方法為加1mL胰酶，胰酶潤(rùn)洗細(xì)胞表面3-4次后，吸走胰酶，放入37度培養(yǎng)箱消化2分鐘。（具體消化時(shí)間請(qǐng)?jiān)谀玫郊?xì)胞前2次傳代時(shí)，及時(shí)觀察，以實(shí)際情況為主）

3)?終止消化時(shí)，用1mL胰蛋白酶抑制劑（1mg/mL）終止，離心去上清，然后用3mL PBS再次清洗細(xì)胞，離心收集后，用新的培養(yǎng)基重懸后鋪板。（消化過(guò)程中，不要拍瓶身，振蕩可促使細(xì)胞聚團(tuán)。）

4)?培養(yǎng)器皿提前使用包被液（10 μg/mL?Fibronectin，10 mg/mL?硫酸軟骨素）處理，促進(jìn)細(xì)胞貼壁。包被時(shí)間至少4小時(shí)，建議過(guò)夜，室溫或37度培養(yǎng)箱包被?？商崆鞍粠讉€(gè)瓶子備用，包被后限一個(gè)月內(nèi)使用。

5)?包被液使用方法：加2-3mL到T25培養(yǎng)瓶或3-4mL到10cm培養(yǎng)皿，放培養(yǎng)箱中，擰上蓋子，自然風(fēng)干。使用時(shí)，未風(fēng)干的包被液槍頭吸走即可，然后加1-2mL PBS清洗表面，吸走PBS后即可接種細(xì)胞。

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參考文獻(xiàn)

Valtink, M., Gruschwitz, R., Funk, R. H., & Engelmann, K. (2008). Two clonal cell lines of immortalized human corneal endothelial cells show either differentiated or precursor cell characteristics. Cells, tissues, organs, 187(4), 286–294.

https://doi.org/10.1159/000113406