全基因組測(cè)序（Whole Genome Sequencing），簡(jiǎn)稱WGS，目前默認(rèn)指的是人類的全基因組測(cè)序。所謂全（Whole），指的就是把物種細(xì)胞里面完整的基因組序列從第一個(gè)DNA開始一直到最后一個(gè)DNA，完完整整地檢測(cè)出來并排列好。因此這個(gè)技術(shù)幾乎能夠鑒定出基因組上任何類型的突變。這種從頭測(cè)序和組裝通常應(yīng)用于沒有參考基因組可用或可用參考質(zhì)量較差的生物體。

?

之前未測(cè)序的基因組必須在測(cè)序后通過從頭方法組裝。然后，該組件可用于其他分析，并為未來的重新測(cè)序項(xiàng)奠定基礎(chǔ)。

?

當(dāng)參考基因組序列可用時(shí)，通常會(huì)執(zhí)行重新測(cè)序。測(cè)序讀數(shù)與參考基因組對(duì)比，以確定基因組中 特定讀數(shù)最匹配的位置。

重測(cè)序通常用于探索個(gè)體、家庭和群體的遺傳變異，特別是在人類遺傳疾病方面。這些研究中對(duì)測(cè)序深度的要求取決于感興趣的變異類型、疾病模型和感興趣區(qū)域的大小。

?

重測(cè)序可以揭示單核苷酸多態(tài)性、小插入或缺失、結(jié)構(gòu)變異和拷貝數(shù)變異。當(dāng)然，特定研究的設(shè)計(jì)取決于所討論的生物學(xué)假設(shè)，與孟德爾病或癌癥體細(xì)胞突變研究相比，人口研究使用不同的測(cè)序策略。

此外，靶向重測(cè)序方法允許在測(cè)序廣度和樣本數(shù)量之間進(jìn)行權(quán)衡：在更小的基因組區(qū)域上，以相同的成本，更多的樣本，可以被測(cè)序到相同的深度。

在這里，我們?cè)谶@些不同的變異類型和疾病模型的背景下討論全基因組測(cè)序 (WGS) 相對(duì)于靶向重測(cè)序方法（包括 WES）的優(yōu)點(diǎn)。

高深度 WGS 是 DNA 重測(cè)序的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，因?yàn)樗梢栽诰幋a蛋白質(zhì)的人類基因組的少數(shù) (1.2%)和其余大多數(shù)非編碼蛋白質(zhì)中查找所有的變異類型，包括SNV、插入缺失、結(jié)構(gòu)變異和CNV-編碼序列。

WES 專注于檢測(cè)蛋白質(zhì)編碼基因中的 SNV 和插入缺失以及如microRNA 序列等其他功能元件 ；因此，它省略了啟動(dòng)子和增強(qiáng)子等調(diào)控區(qū)域。盡管成本因序列捕獲解決方案而異，但 WES 可以比 WGS 便宜一個(gè)數(shù)量級(jí)，以實(shí)現(xiàn)大致相等的蛋白質(zhì)編碼外顯子覆蓋范圍。這些降低的成本提供了極大增加樣本數(shù)量的潛力，這是許多研究的關(guān)鍵因素。然而，WES 有各種限制，如下所述。

?

早期的基因組重測(cè)序研究特別關(guān)注兩類最常見的序列變異，即 SNV 和小插入缺失。 第一個(gè)使用 Illumina 短讀長(zhǎng)技術(shù)測(cè)序的人類基因組表明，盡管幾乎所有純合 SNV都以 15 倍的平均深度處檢測(cè)到，但要檢測(cè)相同比例的雜合 SNV，則需要平均 33 倍的深度。因此，超過 30 倍的平均深度迅速成為事實(shí)上的標(biāo)準(zhǔn)。

盡管讀取質(zhì)量主要由測(cè)序技術(shù)決定，但覆蓋深度的均勻性也會(huì)受到樣品制備的影響。在通過 PCR 進(jìn)行 DNA 擴(kuò)增期間引入的 GC 偏差已被確定為覆蓋率變化的主要來源。消除 PCR 擴(kuò)增可提高基因組高 GC 區(qū)域的覆蓋率并減少重復(fù)讀數(shù)。

在 WES 中，序列捕獲探針雜交效率的差異可能再次歸因于 GC 含量變化，這可能會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)區(qū)域幾乎沒有或沒有覆蓋。覆蓋的均勻性也將受到重復(fù)或低復(fù)雜度序列的影響，這些序列要么限制誘餌設(shè)計(jì)，要么導(dǎo)致脫靶捕獲。

此外，與 WGS 不同，WES 仍常規(guī)使用 PCR 擴(kuò)增，必須對(duì)其進(jìn)行仔細(xì)優(yōu)化以減少 GC 偏差。由于覆蓋范圍的變化增加，需要更大的平均讀取深度才能實(shí)現(xiàn)與 WGS 相同的覆蓋范圍，并且需要 80 倍的平均深度才能覆蓋 89.6%-96.8% 的目標(biāo)堿基。

所有 WES 試劑盒都容易出現(xiàn)參考偏差，這是由與參考序列匹配的捕獲探針引起的，因此傾向于優(yōu)先富集雜合位點(diǎn)的參考等位基因； 這種偏差會(huì)產(chǎn)生假陰性SNV 調(diào)用。

?

我們可以使用分析覆蓋深度的方法從 WGS 和 WES 數(shù)據(jù)中檢測(cè) CNV。這些方法根據(jù)基因組坐標(biāo)堆積對(duì)齊的讀數(shù)，然后計(jì)算窗口中的讀取，以提供整個(gè)區(qū)域的平均深度。然后可以從基因組區(qū)域的平均深度的變化中推斷出拷貝數(shù)的變化。

在 WGS 中，平均深度低至 0.1 倍即可獲得合理的特異性。然而，靈敏度、斷點(diǎn)檢測(cè)和絕對(duì)拷貝數(shù)估計(jì)都隨著讀取深度的增加而提高。

無論平均讀取深度如何，即使在對(duì) GC 偏差和“可映射性”進(jìn)行校正之后，覆蓋深度方法也容易受到由于覆蓋范圍的局部變化而被調(diào)用的誤報(bào)，并且需要跨樣本調(diào)用來減少這種影響。

?

與準(zhǔn)確調(diào)用單個(gè)基因組中的 SNV 和插入缺失所需的深度相比，群體基因組學(xué)研究受益于樣本數(shù)量和測(cè)序深度之間的權(quán)衡，其中許多基因組在低深度（例如，400 個(gè)樣本在，4倍) 及其變體在所有樣本中被聯(lián)合調(diào)用。

對(duì)單個(gè)低深度基因組的變異調(diào)用具有很高的假陽性率，但通過跨樣本組合信息可以減輕這種情況。這種方法以深度測(cè)序的測(cè)序成本的一部分提供了檢測(cè)常見變異的良好功能。

實(shí)際上，即使是超低覆蓋率測(cè)序（即以 0.1-0.5倍 測(cè)序）也能捕獲與單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 陣列幾乎一樣多的常見變異（即等位基因頻率 >1% 的變異）。

相反，可靠地鑒定高度非整倍體基因組或異質(zhì)細(xì)胞群（例如來自腫瘤的細(xì)胞群）中的變異需要比來自正常組織更大的覆蓋深度。 有限感興趣區(qū)域的靶向富集和超深度測(cè)序（即 1,000 倍測(cè)序）可用于研究癌癥樣本中的克隆進(jìn)化，其中特定變體存在于 <1% 的細(xì)胞群中。

鑒定疾病的新發(fā)或隱性變異通常最好通過對(duì)親子三重奏進(jìn)行測(cè)序來實(shí)現(xiàn)。在這種情況下，建議為每個(gè)家庭成員獲得相同的測(cè)序深度，以最大限度地減少先證者的假陽性和父母的假陰性。