熒光蛋白想必大家都不陌生，早在1962年，下村修從維多利亞多管水母中分離到一種能在紫外線激發(fā)下發(fā)出綠色熒光的蛋白，即綠色熒光蛋白?(GFP)?。此后馬丁·查爾菲首次將GFP應(yīng)用于生物學(xué)研究，他通過分子生物學(xué)技術(shù)將GFP的cDNA在線蟲等模式生物中表達(dá)，使人們意識(shí)到GFP作為報(bào)告基因的巨大潛力。錢永健團(tuán)隊(duì)解析了GFP的發(fā)光機(jī)制，并通過突變對(duì)GFP改造，得到了一些熒光亮度更高、吸收峰單一、構(gòu)象折疊效率高的突變體，如GFP-S65T。為了表彰他們?cè)诰G色熒光蛋白研究中做出的巨大貢獻(xiàn)，2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了下村修、馬丁·查爾菲和錢永健三位科學(xué)家。

在綠色熒光蛋白首次面世后，科學(xué)家們又相繼發(fā)現(xiàn)研究出其他熒光蛋白，1999年，Matz等從珊瑚蟲中分離出了能在紫外照射下發(fā)出紅色熒光的蛋白質(zhì)—紅色熒光蛋白?(RFP)?。相比于GFP，它有更高的熒光強(qiáng)度，成像背景低，并能激發(fā)和發(fā)射更長(zhǎng)的波長(zhǎng)。很多時(shí)候，研究者可同時(shí)使用GFP和Ds Red對(duì)不同蛋白質(zhì)進(jìn)行雙標(biāo)記可完成GFP無法獨(dú)自解決的問題。?

隨后科研人員基于光譜特性作了進(jìn)一步的改造，得到了不同顏色的突變體。例如，突變GFP獲得了藍(lán)色熒光蛋白(BFP)?、青色熒光蛋白?(CFP)?、綠色熒光蛋白?(GFP)?和黃色熒光蛋白?(YFP)?四組不同顏色的熒光蛋白，其光譜范圍覆蓋藍(lán)色至黃色。RFP突變衍生出了橙色、紅色和近紅外光譜的熒光蛋白。以上變種的光譜幾乎覆蓋了可見光范圍，也提高了熒光蛋白標(biāo)記選擇的靈活性，也締造了生物科學(xué)界的“彩虹”。

熒光蛋白不僅是科研人員眼中五彩斑斕的色彩，更是強(qiáng)有力的研究工具，熒光標(biāo)記和示蹤是熒光蛋白最基本的功能，也是目前細(xì)胞生物學(xué)研究的重要手段。例如，研究一種蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的分布時(shí)，可將目的蛋白基因和熒光蛋白基因融合到同一質(zhì)粒中，構(gòu)建融合基因表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)的融合蛋白能行使目的蛋白的生物學(xué)功能，又有熒光蛋白的發(fā)光特點(diǎn)。隨后借助激光共聚焦顯微鏡分析目的蛋白的亞細(xì)胞定位以及進(jìn)行啟動(dòng)子分析、基因表達(dá)調(diào)控等的研究。?

除了熒光標(biāo)記和蛋白示蹤功能之外，蛋白質(zhì)互作研究也是熒光蛋白的重要作用。目前，基于熒光蛋白的熒光共振能量轉(zhuǎn)移?(FRET)?技術(shù)和熒光互補(bǔ)?(FC)?技術(shù)已成為研究蛋白互作的有效手段。以FRET技術(shù)為例，F(xiàn)RET現(xiàn)象涉及兩種熒光蛋白，分別作供體和受體, 要求供體的發(fā)射譜與受體的吸收譜重疊，當(dāng)兩者距離很近時(shí)?(1～10 nm)?，光子能量將從供體轉(zhuǎn)移至受體，使受體發(fā)出熒光，表明蛋白間存在相互作用。

熒光蛋白具有那么多的用途，那么我們?nèi)绾卧诳蒲兄羞x擇合適的熒光蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?zāi)?？我們需要考慮以下幾個(gè)方面：?

1.?單體性質(zhì)

將熒光蛋白與目標(biāo)蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，直接地追蹤目標(biāo)蛋白或是定位目標(biāo)蛋白，這就要求熒光蛋白是單體，不能影響目標(biāo)蛋白的功能和定位。因此，我們將熒光蛋白的單體性質(zhì)放在第一位。目前體外檢測(cè)熒光蛋白單體性質(zhì)的方法有分子篩、沉降平衡，可以通過熒光蛋白分子篩的峰圖是否狹窄，單一粗略的判斷其是否為單體，沉降平衡能夠更加準(zhǔn)確的確認(rèn)其聚合性質(zhì)。我們使用熒光蛋白幾乎都是在細(xì)胞內(nèi)或組織內(nèi)，因此我們更加關(guān)心在生理?xiàng)l件下，熒光蛋白的聚合性質(zhì)。在綠色熒光蛋白中單體性質(zhì)比較好的是 mEmerald，該蛋白很少形成大的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，并且目前還沒有稱該蛋白會(huì)影響定位的報(bào)道。相比之下紅色熒光蛋白中沒有一個(gè)單體性質(zhì)特別好，相比較來說，mApple 的單體性質(zhì)最好，但是在使用該蛋白的過程中，發(fā)現(xiàn) mAppple 會(huì)影響某些蛋白的定位。

2.?成熟時(shí)間

熒光蛋白在發(fā)光之前需要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯、折疊等步驟，其中折疊過程占據(jù)了大部分時(shí)間，我們將此過程稱之為成熟時(shí)間。在標(biāo)記短壽命的目標(biāo)蛋白時(shí)，如果熒光蛋白的成熟時(shí)間太長(zhǎng)，可能會(huì)出現(xiàn)在目標(biāo)蛋白開始降解時(shí)，熒光蛋白還沒有發(fā)光，導(dǎo)致無法追蹤及定位目標(biāo)蛋白。因此在選擇熒光蛋白時(shí)，需要考慮其成熟時(shí)間。mEmerald、Dendra2 的成熟時(shí)間比較快，在用 Lipo2000?轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染 U2OS 細(xì)胞時(shí)，轉(zhuǎn)染后四個(gè)小時(shí)就能夠用熒光顯微鏡觀察到了熒光信號(hào)，EGFP 沒有信號(hào)。但是在用 P450?方法檢測(cè)時(shí)，Dendra2 會(huì)形成很大的聚集，表明該熒光蛋白的單體性質(zhì)不好，有可能影響目標(biāo)蛋白的定位和功能，在使用該蛋白的過程中應(yīng)該注意這個(gè)特性。?

3.?PK值

每個(gè)熒光蛋白都有其最合適的 pH 值，即在一定的 pH 值下，熒光強(qiáng)度最高。有的熒光蛋白適合在酸性環(huán)境下使用，相反有的適合在堿性環(huán)境下使用，因此在選擇熒光蛋白時(shí)需要考慮熒光蛋白的 PK 值。在細(xì)胞內(nèi)，大多數(shù)細(xì)胞器內(nèi)及細(xì)胞質(zhì)的 pH 值都在 7.0?左右，然而溶酶體內(nèi)的 pH 值就比較低，因此常規(guī)的熒光蛋白并不適合用于標(biāo)記溶酶體內(nèi)的蛋白。mCherry 的 PK 值比較低，適合在酸性的環(huán)境下使用，可以用于標(biāo)記溶酶體內(nèi)的蛋白，但是該熒光蛋白有一定的二聚性質(zhì)，可能會(huì)影響目標(biāo)蛋白的定位。

4.?N端或C端熒光蛋白與目的蛋白融合表達(dá)可能會(huì)影響目的蛋白的折疊，這取決于目的蛋白折疊過程中，熒光蛋白所在的那一端有沒有參與蛋白質(zhì)的折疊。例如，如果目的蛋白的 C 端會(huì)被折疊入目的蛋白的內(nèi)側(cè)，那么我們把熒光蛋白標(biāo)記在目的蛋白的 C 端，將獲得不到熒光信號(hào)；有些目的蛋白在后翻譯的過程會(huì)切掉一段，如果熒光蛋白處于被切的一端，那么就不能獲得準(zhǔn)確的目的蛋白的定位信息。如果標(biāo)記的目的蛋白是一個(gè)新的蛋白，建議分別進(jìn)行 N 端和 C 端融合表達(dá)，以此來確定哪一個(gè)是最好的選擇。? ? ? ??

當(dāng)然選擇熒光蛋白的注意事項(xiàng)不止以上提及的方面，需要結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行選擇，希望能給熱愛科研的你提供幫助。

作者：海星生物? ? ? ?

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