外泌體（Exosome）是一種由活細(xì)胞分泌到細(xì)胞外環(huán)境的膜性小囊泡，體內(nèi)含有mRNA、miRNAs等非編碼RNA和多種蛋白質(zhì)。在病理條件下，受影響的細(xì)胞分泌的外泌體將失調(diào)的生物物質(zhì)轉(zhuǎn)運到靶細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞功能失調(diào)。其囊泡結(jié)構(gòu)還可以保護(hù)外泌體中的核酸不受RNA酶降解，保留完整的RNA序列結(jié)構(gòu)和生物活性。它作為體液活檢標(biāo)志物之一，近幾年研究熱度持續(xù)攀升，應(yīng)用外泌體轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)可以更全面、精準(zhǔn)反映真實的轉(zhuǎn)錄組信息。目前廣泛應(yīng)用于疾病診斷及治療中。

2023年03月08日，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院、斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院（美國加州斯坦福）、中國神經(jīng)疾病臨床研究中心、北京大學(xué)國際醫(yī)院以及首都醫(yī)科大學(xué)友誼醫(yī)院的研究團(tuán)隊聯(lián)合發(fā)表在JouRNAl of Cerebral Blood Flow & Metabolism上（IF：6.690）為“RNA profiling of sEV (small extracellularvesicles)/exosomes reveals biomarkers and vascular endothelial dysplasia with moyamoya disease”的研究論文。本文首次探究了與煙霧病發(fā)病相關(guān)的外泌體RNA的差異表達(dá)，如hsa_circ_0001491hsa_circ_0051937的過表達(dá)，可能與煙霧病的血管生成有關(guān)；hsa_circ_0090577下調(diào)可能與血管閉塞有關(guān)。這些結(jié)果說明外泌體RNA在煙霧病中作為生物學(xué)標(biāo)記物的效用。

研究背景

煙霧病（Moyamoya disease MMD）是一組以雙側(cè)頸內(nèi)動脈末端及其大分支血管進(jìn)行性狹窄或閉塞，且在顱底伴有異常新生血管網(wǎng)形成為特征的閉塞性疾病。其因異常側(cè)支血管形成的機(jī)制尚不清楚，阻礙了煙霧病治療藥物的開發(fā)。

顱內(nèi)動脈粥樣硬化疾?。╥ntracranial atherosclerotic disease，ICAD），其本質(zhì)為各處腦動脈狹窄或閉塞性病變，ICAD作為缺血性卒中的主要病因，盡管發(fā)病率在近年來顯著降低，但復(fù)發(fā)風(fēng)險仍很高。為了確定有效治療的新靶點，需要詳細(xì)研究ICAD進(jìn)展的分子機(jī)制。

試驗設(shè)計

為探究外泌體RNA在煙霧病和ICAD發(fā)病機(jī)制中的作用。作者設(shè)置20例患病樣本（A組：2例出血性MMD和8例缺血性MMD、B組：10例ICAD）和10名健康對照（10名參與者），用超濾方法提取血清衍生外泌體(serum-derived exosomes，SDEs)，使用基因芯片WT Pico試劑盒提取全RNA并建立RNA譜（青蓮百奧提供技術(shù)支持）。探究6種候選RNA?hsa_circRNA_0000583、hsa_circRNA_0090577、hsa_circ_0001491、hsa_circ_0076043、hsa_circRNA_0051937和hsa_circ_0074463對人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human brain microvascularendothelial cells?，HBMEC)的影響。

結(jié)果速遞

1：全RNA譜質(zhì)量驗證及功能注釋

文章選用四種尖刺探針（(BioB、BioC、BioD和CreX)、堿反應(yīng)特征(可正可負(fù))分析并驗證總RNA雜交質(zhì)量良好(P＜0.01)(圖1(a)(b)(c)。

作者對樣本間進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析。與健康對照相比，在煙霧病患者有1486個RNA下調(diào)，2405個RNA上調(diào)；ICAD患者有834個RNA下調(diào)，1001個RNA上調(diào)。與煙霧病患者相比，ICAD患者有2184個RNA下調(diào)，1261個RNA上調(diào)（圖1（d）-（i））。

文章對煙霧病患者中的1486個下調(diào)RNA和2405個上調(diào)RNA進(jìn)行了GO注釋。注釋結(jié)果顯示，下調(diào)和上調(diào)的基因大都與免疫相關(guān)；此外，27個miRNA與中性粒細(xì)胞脫顆粒相關(guān)，表明煙霧病患者存在免疫功能障礙；12個下調(diào)的RNA被注釋為免疫應(yīng)答，其中一些還與補(bǔ)體激活的調(diào)節(jié)有關(guān)（圖2（a））。在細(xì)胞組分方面有88種上調(diào)的RNA與細(xì)胞外外泌體顯著相關(guān)，這表明細(xì)胞外外泌體可能在煙霧病的通路發(fā)生中發(fā)揮重要作用。在分子功能上，178個下調(diào)的RNA與蛋白結(jié)合相關(guān)，11個上調(diào)的RNA與RNA結(jié)合明顯相關(guān)，提示煙霧病患者基因表達(dá)失調(diào)(圖2（b))。RNA富集分析結(jié)果顯示，煙霧病患者存在免疫功能障礙。8個下調(diào)的RNA與nod樣受體信號通路相關(guān)，6個下調(diào)的RNA與toll樣受體信號通路相關(guān)，它們都在炎癥和免疫中發(fā)揮重要作用。此外，11種上調(diào)的RNA與分化簇分子顯著相關(guān)。分子簇分子是用于鑒定和表征白細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記(圖2（c))。

從差異表達(dá)的RNA中，作者在MMD患者(n＝5)和ICAD患者(n＝5)的SDEs中挑選了6個差異顯著的RNA（表1）并對其進(jìn)行了qPCR差異驗證(圖3（a）-（i）)。

2：候選RNA低表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建及小管形成活性驗證

文章選擇hsa_circRNA_0000583、hsa_circRNA_ 0090577和hsa_circRNA_0051 937作為候選RNA，以識別它們在MMD和ICAD中的功能。構(gòu)建候選RNA低表達(dá)細(xì)胞系并用cck8試劑盒檢測HBMEC在24h、48h和72h的活力。

如圖所示，shRNA-NC組相比，sh-hsa_circrna_0000583、sh-hsa_circRNA_0090577和sh-hsa_circRNA_0051937組細(xì)胞活力顯著降低（圖4）。

shRNA-NC組相比sh-hsa_circRNA_0000583、sh-hsa_circRNA_0090577和sh-hsa_circRNA_0051937細(xì)胞凋亡明顯增加（圖5（e）、（f））。EdU細(xì)胞增殖試驗表明?shRNA-NC組相比sh-hsa_circRNA_0000583、sh-hsa_circRNA_0090577、sh-hsa_circRNA_0051937?細(xì)胞增殖受到明顯抑制圖（圖5（a）、（b））。

候選基因HBMEC小管的形成sh- hsa_circRNA_0000583、sh- hsa_circrna_0090577和sh- hsa_circrna_0051937組的小管和分支點的長度明顯短于shRNA-NC組(圖5（c）、（d）)。與shRNA-NC組相比，sh- hsa_circrna_0000583組、sh-hsa_circRNA_0090577組和sh-hsa_circRNA_0051937組的小管形成數(shù)量顯著減少。sh-hsa_circRNA_0000583sh-hsa_circRNA_0090577和sh-hsa_circRNA_0051937組比shRNA-NC組高。

總結(jié)

文章測定煙霧病和ICAD患者的外泌體RNA譜，發(fā)現(xiàn)了幾種與健康對照者表達(dá)顯著差異的RNA。探索失調(diào)的RNA對HBMEC小管形成的影響也有助于理解這些RNA的失調(diào)如何影響煙霧病的發(fā)病機(jī)制，文章結(jié)果為研究煙霧病的生物學(xué)標(biāo)志物提供了方向。