時空簡訊第49期。

肺癌分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）兩種主要組織學(xué)亞型，其中NSCLC占所有肺癌的70%~80%，具有高度異質(zhì)性的特征。而腫瘤異質(zhì)性與其發(fā)生、轉(zhuǎn)移、進(jìn)展及治療反應(yīng)密切相關(guān)，因此，剖析肝癌免疫微環(huán)境的空間景觀，對于探明其發(fā)病機制、篩選疾病標(biāo)志物及開發(fā)新治療策略至關(guān)重要。

在此，我們遴選了有關(guān)肝癌發(fā)病機制、診斷與治療反應(yīng)的8篇優(yōu)質(zhì)前沿文章，展示時空及單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)在肝癌研究中取得的最新成果，供了解參考。

病理機制/Pathological Mechanism

譜系追蹤揭示肺腺癌的系統(tǒng)動力學(xué)、可塑性和路徑

Cell?[IF: 66.850]

① 使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建了一個Kras;Trp53（KP）驅(qū)動的小鼠肺腺癌模型（KP-tracer），然后采用標(biāo)記慢病毒-Cre條碼的構(gòu)建體（lenti-Cre-BC）誘導(dǎo)腫瘤，并通過scRNA-seq證明了該小鼠模型可實現(xiàn)連續(xù)、高分辨率的體內(nèi)癌癥譜系追蹤。

② 對40,386個單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)具有不同表達(dá)程序的罕見亞克隆在腫瘤演變過程中擴增，該過程具有DNA拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）、細(xì)胞周期評分和適應(yīng)性評分增加的特征。

③ 結(jié)合適應(yīng)性評分和腫瘤單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，揭示了KrasLSL-G12D/+; Trp5/fl/fl（KP）腫瘤的適應(yīng)性相關(guān)基因程序，其中與腫瘤擴張始終相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序可進(jìn)一步分解成“胃與內(nèi)胚層信號”、“間質(zhì)轉(zhuǎn)換標(biāo)記基因和神經(jīng)基因”和“經(jīng)典間充質(zhì)和轉(zhuǎn)移前基因”3個獨立的模塊，且都與肺腺癌不良預(yù)后顯著相關(guān)。

④ 基于腫瘤系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，提出Effective Plasticity評分用于評估細(xì)胞狀態(tài)變化的頻率，即可塑性，發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性是由細(xì)胞狀態(tài)可塑性的瞬時增加驅(qū)動的。

⑤ 開發(fā)Phylotime用于量化單個細(xì)胞與其祖細(xì)胞的演化距離，發(fā)現(xiàn)KP腫瘤的演化路徑主要有兩條，且每個演化軌跡都有明顯的轉(zhuǎn)錄變化。

⑥ 對敲除Lkb1的KP腫瘤（KPL）和敲除Apc的KP腫瘤（KPA）共計32,146個細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)這兩種抑癌基因的缺失對腫瘤細(xì)胞狀態(tài)、可塑性和演化路徑的影響不同，如，KPL腫瘤處于間質(zhì)轉(zhuǎn)換前狀態(tài)且可塑性降低，而KPA腫瘤處于Apc特異性早期、間充質(zhì)和轉(zhuǎn)移狀態(tài)，并產(chǎn)生獨特的發(fā)育軌跡。（大禹）

Lineage tracing reveals the phylodynamics, plasticity, and paths of tumor evolution.

2022.05.05; DOI: 10.1016/j.cell.2022.04.015

研究文章：小鼠，肺，肺腺癌，譜系追蹤，系統(tǒng)發(fā)生，腫瘤演變，scRNA-seq，MULTI-seq，CRISPR/Cas9，轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性；Dian Yang, Matthew G. Jones, Nir Yosef, Tyler Jacks，Jonathan S. Weissman; University of California, Massachusetts Institute of Technology; USA.

多區(qū)域單細(xì)胞測序解析肺腺癌的空間和細(xì)胞結(jié)構(gòu)

Cancer Discovery?[IF: 39.397]

①對來自新切除的早期肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）組織、癌旁和遠(yuǎn)端正常肺組織的所有細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq分析，繪制了早期LUAD及近遠(yuǎn)端肺的全面單細(xì)胞圖譜（共15,132個細(xì)胞），揭示了早期肺癌演變的特征，為制定早期肺癌治療策略提供了寶貴資源。

② 70,030個上皮細(xì)胞形成10個不同的簇，其中主要來自癌癥樣本的惡性富集簇（C9）的亞類在不同個體之間及個體內(nèi)腫瘤和癌旁樣本間存在異質(zhì)性。

③ 表征了淋巴細(xì)胞的空間動力學(xué)，揭示了10種轉(zhuǎn)錄上不同的淋巴樣細(xì)胞類型，并發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞狀態(tài)和特性改變可能是早期LUAD中免疫重塑的原因。

④ 從45,803個髓細(xì)胞中識別出13種不同的亞群；隨著與LUADs的空間接近程度增加，抗原呈遞相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著降低，巨噬細(xì)胞抗原減少，促炎基因表達(dá)明顯減少，抗炎基因表達(dá)明顯增加。

⑤ CD24是早期LUAD中細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的核心，它與促腫瘤免疫環(huán)境形成和不良預(yù)后相關(guān)，并促進(jìn)體內(nèi)LUAD生長。（DL/Lina）

Resolving the spatial and cellular architecture of lung adenocarcinoma by multiregion single-cell sequencing.

2021.05.10; DOI：10.1158/2159-8290.CD-20-1285

研究文章；人，肺，肺腺癌，腫瘤微環(huán)境，腫瘤異質(zhì)性，空間演變，scRNA-seq；Ansam Sinjab, Guangchun Han, Linghua Wang, Humam Kadara; The University of Texas MD Anderson Cancer Center; USA.

染色體外DNA擴增導(dǎo)致小細(xì)胞肺癌的異質(zhì)性且與較差預(yù)后相關(guān)

Cancer Discovery?[IF：28.200]

① 整合全基因組測序、遠(yuǎn)程光學(xué)映射、單細(xì)胞DNA測序和熒光原位雜交，繪制了首個小細(xì)胞肺癌（small-cell lung cancer，SCLC）染色體外DNA（ecDNA）的綜合圖譜，并描述了一種控制MYC驅(qū)動的SCLC異質(zhì)性的新機制。

② ecDNA是SCLC關(guān)鍵致癌基因擴增和腫瘤間異質(zhì)性的主要來源；除作為癌基因擴增和融合的載體外，ecDNA還使遠(yuǎn)端DNA元件更加接近，允許遠(yuǎn)端增強子和癌基因之間的染色質(zhì)接觸，從而發(fā)揮SCLC轉(zhuǎn)錄擴增單位的作用。

③ ecDNA提供的轉(zhuǎn)錄靈活性可能是SCLC腫瘤內(nèi)異質(zhì)性、治療耐藥性和轉(zhuǎn)移快速擴大的基礎(chǔ)，且具有復(fù)雜ecDNA擴增的SCLC的生存結(jié)果明顯較差。

④ 證實無細(xì)胞核小體檢測可以非侵入性地檢測血漿中的ecDNA擴增，促進(jìn)其在SCLC和其他癌癥中的全基因組的查找。（Lina）

Extrachromosomal DNA amplification contributes to small cell lung cancer heterogeneity and is associated with worse outcomes.

2023.04.03; DOI: 10.1158/2159-8290.CD-22-0796

研究文章；人，肺，小細(xì)胞肺癌，染色體外DNA，腫瘤異質(zhì)性，腫瘤演變，單細(xì)胞DNA測序，熒光原位雜交；L?rinc Sándor Pongor, Anish Thomas; National Cancer Institute, NIH; USA.

人和小鼠的肺癌單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究揭示個體及物種間保守的髓系細(xì)胞群

Immunity?[IF: 21.522]

① 應(yīng)用scRNA-seq，繪制了非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者和小鼠的腫瘤浸潤髓系細(xì)胞（tumor-infiltrating myeloid cells，TIMs）的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組景觀，并系統(tǒng)地比較細(xì)胞狀態(tài)，揭示了個體和物種間保守的髓系細(xì)胞群，并為TIMs作為免疫療法靶點的研究奠定了基礎(chǔ)。

② 對7例NSCLC患者的TIMs進(jìn)行scRNA-seq分析，確定了25種不同的TIMs狀態(tài)，其中大多數(shù)TIMs狀態(tài)在不同患者中重復(fù)出現(xiàn)。

③ 對肺癌小鼠的TIMs進(jìn)行單細(xì)胞測序，并與人的TIMs進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)樹突細(xì)胞和單核細(xì)胞的群體結(jié)構(gòu)在兩物種間幾乎完全一致，中性粒細(xì)胞亞群保守，巨噬細(xì)胞存在物種差異；而NSCLC患者血液中的髓細(xì)胞群體結(jié)構(gòu)與其TIMs結(jié)構(gòu)的重疊有限。（Nano Lyu）

Single cell transcriptomics of human and mouse lung cancers reveals conserved myeloid populations across individuals and species.

2019.04.09; DOI: 10.1016/j.immuni.2019.03.009

研究文章；人，小鼠，肺，非小細(xì)胞肺癌，腫瘤浸潤髓系細(xì)胞，scRNA-seq；Rapolas Zilionis, Camilla Engblom, Christina Pfirschke, Virginia Savova，Mikael J. Pittet, Allon M. Klein；Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, Massachusetts General Hospital Research Institute and Harvard Medical School; USA.

診斷與治療/Diagnosis and Treatment

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜分析揭示EOMES+CD8+T細(xì)胞與獲得性EGFR-TKI耐藥性之間的相關(guān)性

Drug Resistance Updates?[IF：22.841]

① 整合分析來自正常（n=4）、酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKI）治療前（TKI na?ve，TN；n=8）、殘留疾病（residual disease，RD；TKI敏感組，n=10）和進(jìn)行性疾?。╬rogressive disease，PD；TKI耐藥組，n=7）樣本的scRNA-seq數(shù)據(jù)，證明了 EOMES+CD8+T細(xì)胞與獲得性EGFR-TKI耐藥性之間的相關(guān)性，支持脫中胚蛋白（eomesodermin，EOMES）作為治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物的效用。

② 肺癌患者在獲得性對TKI產(chǎn)生耐藥性后，EOMES+CD8+T細(xì)胞顯著增加，并與不良生存率相關(guān)。

③ EOMES+CD8+T細(xì)胞的增加可能與TRM T細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和代謝重編程有關(guān)。

④ 外周血中的EOMES+CD8+T細(xì)胞有可能成為一種很有前景的EGFR-TKIs耐藥性的生物標(biāo)志物。（Max）

Single-cell transcriptional profiling uncovers the association between EOMES+CD8+T cells and acquired EGFR-TKI resistance.

2022.12.15; DOI: 10.1016/j.drup.2022.100910

研究文章；人，肺，肺癌，酪氨酸激酶抑制劑治療，治療反應(yīng)，EGFR-TKI耐藥性，T細(xì)胞，表皮生長因子受體，生物標(biāo)志物，scRNA-seq；Guosheng Wang, Jiaxing Sun, Jing Zhang, Qiping Zhu, Feilong Wang, Qi Yin, Yuan Wan; 同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海東醫(yī)院；中國

技術(shù)創(chuàng)新/Technology?Innovation

新鮮肺癌樣本中新抗原反應(yīng)性T細(xì)胞高表達(dá)CD39和CXCL13

Cancer Cell? [IF：38.585]

① 結(jié)合CITE-seq與TCR-seq兩種技術(shù)，開發(fā)了TCR-CITE-seq，可以在單細(xì)胞水平上提供細(xì)胞表面蛋白、轉(zhuǎn)錄組和TCR序列信息。

② 4例非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的新鮮腫瘤組織和配對外周血樣本的全外顯子組測序分析，在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor-infifiltrating lymphocytes，TIL）中鑒定出7個突變反應(yīng)性TCR。

③ 比較新抗原反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞與其他CD8+T細(xì)胞的表面蛋白和基因的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD39和CXCL13在新抗原反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞中高表達(dá)。

④ 通過評估CD39+CXCL13+頻率最高的T細(xì)胞克隆型和CD39-高頻克隆型對新生抗原的反應(yīng)強弱，發(fā)現(xiàn)同時表達(dá)CD39蛋白和CXCL13 mRNA的高頻TCR克隆型（clonotype）這一簡單特征，可以用于鑒定新抗原反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞。（大禹）

A phenotypic signature that identifies neoantigen-reactive T cells in fresh human lung cancers.

2022.04.21; DOI: 10.1016/j.ccell.2022.03.012

研究文章；人，肺，非小細(xì)胞肺癌，新抗原，T細(xì)胞，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，CITE-seq，TCR-seq, TCR-CITE-seq，單細(xì)胞測序；Ken-ichi Hanada, James C. Yang；National Cancer Institute, National Institutes of Health; USA.

Well-paired-seq ：一種高通量、高利用率、低成本的單細(xì)胞測序新方法

Small Methods?[IF: 15.367]

① 開發(fā)了一種高通量、高利用率、低成本的單細(xì)胞測序新方法：Well-paired-seq。該方法協(xié)同尺寸排阻和局部準(zhǔn)靜態(tài)動力學(xué)的雙層微孔芯片，突破泊松分布，解決了細(xì)胞損失、mRNA交叉污染、背景干擾等問題，實現(xiàn)了超高通量的scRNA-seq分析。

② Well-paired-seq芯片的各項性能評估：細(xì)胞和微球的配對率為82%，細(xì)胞捕獲率約為90%；芯片具有強大的游離RNA和細(xì)胞團去除能力，減少了下游的數(shù)據(jù)分析的技術(shù)差異和背景噪音。

③ 將人細(xì)胞（Calcein AM染色的K562）和小鼠細(xì)胞（DiO染色的NIH/3T3）數(shù)量按1:1混合，生成了包括2,810個人類細(xì)胞和2,254個小鼠細(xì)胞的高質(zhì)量文庫，多胞率低于3.5，并將小鼠細(xì)胞按1:300的比例添加到人類細(xì)胞中，檢測顯示的兩物種比例與預(yù)期相符（1:350），驗證了Well-paired-seq可以實現(xiàn)對稀有單細(xì)胞的無偏倚檢測。

④ 應(yīng)用Well-paired-seq分別對由5種人肺腺癌細(xì)胞系組成的單細(xì)胞混合樣品、兩名健康人的PBMC樣品進(jìn)行分析，均可注釋到不同功能狀態(tài)下的關(guān)鍵細(xì)胞類型，表明該技術(shù)具有對復(fù)雜樣本進(jìn)行細(xì)胞類型分析的能力。（寒鶴）

Well-Paired-Seq: A size-exclusion and locally quasi-static hydrodynamic microwell chip for single-cell RNA-Seq.

2022.05.06; DOI: 10.1002/smtd.202200341

研究文章；人，小鼠，肺，肺腺癌，Well-paired-seq，scRNA-seq，高通量測序，雙層微孔芯片；Kun Yin，Jia Song，Chaoyong Yang；廈門大學(xué)，上海交通大學(xué)附屬仁濟醫(yī)院；中國

空間組學(xué)帶來肺癌腫瘤生物學(xué)新見解

Lung Cancer?[IF: 5.705]

① 肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因。新興技術(shù)空間組學(xué)（基因組/轉(zhuǎn)錄組/蛋白質(zhì)組）的出現(xiàn)，能更深刻地解析與原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性肺癌腫瘤異質(zhì)性相關(guān)的復(fù)雜性，助力開發(fā)更有效的肝癌治療方法。??

② 描述了針對肝癌，尤其是在晚期NSCLC的免疫檢查點抑制劑治療療效、腫瘤突變負(fù)荷和腫瘤微環(huán)境方面取得的研究進(jìn)展，并指出從空間維度解析腫瘤免疫微環(huán)境的重要性。

③ 回顧了目前應(yīng)用于肝癌研究的各種空間組學(xué)技術(shù)（如MERFISH、Visium、DSP、SMI、CODEX等），并認(rèn)為空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)與先進(jìn)成像技術(shù)的結(jié)合，會有助于進(jìn)一步深入了解NSCLC組織生物學(xué)，并有望成為預(yù)測治療反應(yīng)可能性的強大工具。（郭浩冰/Lina）

The Pandora’s box of novel technologies that may revolutionize lung cancer.

2021.07.19; DOI: 10.1016/j.lungcan.2021.06.022

綜述；肺，肺癌，非小細(xì)胞肺癌，免疫治療，腫瘤微環(huán)境，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，空間蛋白組學(xué)；Habib Sadeghi Rad, Arutha Kulasinghe; Queensland University of Technology, Translational Research Institute, Princess Alexandra Hospital; Australia.