一.?RepeatMasker簡(jiǎn)介:

基因組組裝完成后，進(jìn)行基因預(yù)測(cè)和注釋。由于基因組中存在重復(fù)序列結(jié)構(gòu)區(qū)，特別是高等真核生物，重復(fù)序列占了相當(dāng)大的比例，會(huì)影響基因預(yù)測(cè)的質(zhì)量，也會(huì)帶來不必要的資源消耗，因此在基因預(yù)測(cè)前，首先要檢測(cè)并屏蔽基因組中的重復(fù)序列。

不過，也有一些人在注釋基因組重復(fù)序列結(jié)構(gòu)時(shí)，也可能是專注于某些特定研究，例如，某些重復(fù)元件可能參與了重要功能，我們期望定位它們的位置，這種情況下需要識(shí)別精準(zhǔn)。

那么，這時(shí)候就得使用檢測(cè)重復(fù)序列的工具了，先來學(xué)習(xí)RepeatMasker。

RepeatMasker是重復(fù)序列檢測(cè)的常用工具，通過與數(shù)據(jù)庫相似性比對(duì)來準(zhǔn)確識(shí)別或屏蔽基因組中的重復(fù)序列，屬于同源預(yù)測(cè)注釋的方式，依賴于RepBase數(shù)據(jù)庫和第三方比對(duì)軟件（RMBlast、Crossmatch、HMMER、ABBlast），是重復(fù)序列注釋的重要軟件。

二.安裝:

首先是官網(wǎng)：

http://www.repeatmasker.org/RepeatMasker/

通過WSL在個(gè)人電腦上安裝：

Conda install -c bioconda trf

Conda install -c bioconda rmblast

下載RepeatMasker-4.1.2-p1.tar.gz

tar -zxvf RepeatMasker-4.1.2-p1.tar.gz

./configure后，根據(jù)提示指定TRF和rmblast所在位置

在Libraries里會(huì)生成一個(gè)RepeatMaskerLib.h5文件，這就是Dfam+RepBase的整合。

三．運(yùn)行:

首先確定數(shù)據(jù)庫中是否收錄了目標(biāo)物種：

一些教程是利用./util/queryRepeatDatabase.pl -tree來查看，但我沒有找到queryRepeatDatabase.pl文件；

通過“Libraries/taxonomy.dat”查看物種信息，所有已收錄物種的名稱都存儲(chǔ)在該文件中，暫時(shí)找不到工具正確打開，按照文本文件去去打開后會(huì)有很多亂碼，查詢效果不佳，希望有了解的同學(xué)、老師看見后能夠告訴我；

命令行(參考一篇Cell文章)：

RepeatMasker -nolow -no_is -norna -parallel 4 -lib /Libraries/RepeatMasker.lib genomic.fna -dir /zhushi/repeatmasker > repeatmasker.log >&1 &

參數(shù)詳解：

- nolow，不掩蓋低復(fù)雜度的DNA或簡(jiǎn)單的重復(fù)序列;

-no_is，跳過細(xì)菌插入元素檢驗(yàn)；

-norna，不掩蓋小RNA（偽）基因；

-parallel 4，并行計(jì)算，多線程；

-lib [filename] Allows use of a custom library (e.g. from another species)

-dir,?輸出結(jié)果目錄；

參考的命令行并沒有-species參數(shù)，且-species和-lib參數(shù)沖突，只能設(shè)置其中一個(gè)，理解查詢了一下對(duì)這兩個(gè)參數(shù)還是有些不明白；

四.結(jié)果解讀：

大約32h后，程序結(jié)束，非常慢，下一次加線程數(shù)，結(jié)果生成如下四個(gè)文件：

.*cat

記錄了輸入的基因組序列和數(shù)據(jù)庫中參考重復(fù)序列的比對(duì)詳情，該文件默認(rèn)生成。

會(huì)存在個(gè)別堿基的差異，其中“i”和“v”分別代表了堿基轉(zhuǎn)換（transitions）和顛換（transversions），“-”表示該位點(diǎn)存在堿基插入/刪除。

.*tbl文件, 重復(fù)序列統(tǒng)計(jì)文件:

包含了基因組長(zhǎng)度、GC含量、重復(fù)區(qū)長(zhǎng)度以及重復(fù)區(qū)各類別基本統(tǒng)計(jì)信息等。其中，“bases masked”就是重復(fù)序列的總長(zhǎng)度和在基因組中的占比，視物種而定，一般都是比較可靠的。

*.out文件, 重復(fù)序列統(tǒng)計(jì)文件：

一共十五列，每一列含義如下圖：

需要注意，部分注釋會(huì)在ID列會(huì)有*標(biāo)識(shí)，表明該區(qū)域有兩條比對(duì)，*標(biāo)記結(jié)果最佳，通常這部分大部分重疊或者是包含關(guān)系，可以選擇其中一個(gè);

通過這個(gè)*.out文件（或下文的gff文件），就可以去定位你期望關(guān)注的特殊類型的重復(fù)序列元件在基因組中的位置了，后續(xù)可再自寫腳本根據(jù)位置信息將這段序列提取出來，或者更進(jìn)一步研究它們的功能等。

生成gff3文件：

可以使用RepeatMasker提供的工具將結(jié)果轉(zhuǎn)化為gff3， 但是需要注意，這里的gff3不是標(biāo)準(zhǔn)的gff3

RepeatMasker/perl rmOutToGFF3.pl *.fa.out > *.gff3

*.masked文件, 屏蔽后的序列：

相較于原始輸入fasta文件中的序列，masked文件中將其中重復(fù)序列部分屏蔽為了N堿基，該文件默認(rèn)生成。

注意區(qū)分，這里有的N堿基是屏蔽的重復(fù)序列，而有的N堿基則是原來這個(gè)基因組fasta文件中就有的（一般為gap）。

該文件作為后續(xù)基因序列預(yù)測(cè)的輸入文件。這樣，基因預(yù)測(cè)時(shí)就不會(huì)再考慮這些重復(fù)序列區(qū)域（因?yàn)檫@些區(qū)域的堿基已經(jīng)屏蔽為了N堿基，不會(huì)被識(shí)別），縮小了基因組范圍，大大減少了資源消耗，提升準(zhǔn)確度。

*.polyout文件：

命令行中通過-poly參數(shù)，可額外將預(yù)測(cè)結(jié)果.out中的微衛(wèi)星注釋識(shí)別出來，單獨(dú)整理為一張表，文件結(jié)構(gòu)同.out。

如果你不想將微衛(wèi)星視作嚴(yán)格的重復(fù)序列類型，可通過.polyout文件中的注釋位置，將.out中的微衛(wèi)星去除。那么，為什么不直接在.out中根據(jù)注釋作篩選呢？因?yàn)槲⑿l(wèi)星屬于“Simple_repeat”的一種，但.out中并非所有“Simple_repeat”都是微衛(wèi)星，所以直接去篩選很難操作。

當(dāng)然，也有很多人不將“Simple_repeat”視作嚴(yán)格的重復(fù)序列類型，如果你也這么認(rèn)為，直接在*.out中過濾掉所有注釋為“Simple_repeat”的結(jié)果就可以了。

五．報(bào)錯(cuò)信息：

一開始我在服務(wù)器上安裝，分別對(duì)以下幾個(gè)軟件、數(shù)據(jù)庫進(jìn)行配置：

1.Perl和Python3以及TRF非常好安裝，基本上在官網(wǎng)上下載后解壓就能用；

2.HMMER見我的公眾號(hào)另一篇文章基因功能預(yù)測(cè)工具-HMMER的安裝；

3.Dfam和Repeat(https://www.girinst.org/repbase/update/)數(shù)據(jù)庫：

Dfam數(shù)據(jù)庫內(nèi)容見我另一篇公眾號(hào)文章，Dfam-轉(zhuǎn)座元件TEs數(shù)據(jù)庫, 其中RepeatMasker/Libraries目錄下已經(jīng)有了需要的Dfam.h5文件;

Repeat數(shù)據(jù)庫進(jìn)入DOWNLOAD頁面下載,

tar -zxvf RepBaseRepeatMaskerEdition-20181026.tar.gz

將解壓出來的：RMRBSeqs.embl和README.RMRBSeqs文件放到RepeatMasker/Libraries目錄下；

4． h5py python 模塊，pip3 不是pip，因?yàn)橛胮ip3進(jìn)行安裝時(shí)報(bào)了錯(cuò)，就用conda install h5py安裝在miniconda3/lib/python3.8/site-packages/目錄下(后面證實(shí)安裝錯(cuò)誤)。

然后正式開始安裝RepeatMasker：

tar -zxvf RepeatMasker-4.1.2-p1.tar.gz

./configure后，根據(jù)提示指定TRF和HMMER所在位置，然后開始報(bào)錯(cuò)了：

將miniconda3/lib/python3.8/site-packages/目錄下的h5py文件夾復(fù)制到RepeatMasker文件夾下，再次perl ./configure，最后提示如下：

雖然有黃色的cannot提示,先接著往下運(yùn)行，運(yùn)行時(shí)報(bào)錯(cuò)：

運(yùn)行命令：RepeatMasker -nolow -no_is -norna -parallel 4 -lib /home/ /RepeatMasker/Libraries/RepeatMasker.lib canu_removedup.fa

報(bào)錯(cuò)信息：

RepeatMasker version 4.1.2-p1

Search Engine: HMMER [ 3.3.2 (Nov 2020) ]

Taxonomy::new() needs a path for a famdb file!

?at /public/home/lvqiang/software/RepeatMasker/RepeatMasker line 635.

后來我查了一下gitlib上issue欄目，作者這樣回復(fù)：

還是沒有正確安裝h5py模塊，這次想辦法讓軟件去識(shí)別miniconda3/lib/python3.8/site-packages/目錄下的h5py模塊去，通過修改famdb.py文件，還是沒有成功。

錯(cuò)誤推測(cè)：因?yàn)槲矣玫姆?wù)器系統(tǒng)安裝的是python2, 我在我目錄下安裝了python3，很有可能是兩個(gè)版本的python起了沖突，導(dǎo)致一些混亂，以后有網(wǎng)后，找個(gè)時(shí)間解決一下這個(gè)問題。

六.補(bǔ)充：

Repeat數(shù)據(jù)庫下載鏈接：

https://www.girinst.org/server/RepBase/protected/repeatmaskerlibraries/RepBaseRepeatMaskerEdition-20181026.tar.gz;

參數(shù)：

參考：https://www.jianshu.com/p/ffdbedae80fa

七．遺留問題：

-species 和 -lib 參數(shù)設(shè)置；

Linux系統(tǒng)下h5py安裝模塊失??；

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