如何從總RNA中分離mRNA
總RNA的組成是什么？
RNA分離的結(jié)果稱為總RNA。它由細(xì)胞產(chǎn)生的所有三種主要類型的RNA組成。它們是mRNA，tRNA和rRNA。tRNA和rRNA都有助于翻譯。真核mRNA的大小為0.5-20 kb。轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）在翻譯過程中帶來相應(yīng)的氨基酸。它有76-90個堿基對長，由反密碼子區(qū)域組成，反密碼子區(qū)域與mRNA上的特定密碼子互補(bǔ)。核糖體RNA（rRNA）是核糖體的一種成分。一些人類rRNA長5kb。
超過90%的總RNA由tRNA和rRNA組成?？俁NA中只有1-5%是mRNA。一個典型的哺乳動物細(xì)胞每個細(xì)胞可能由大約500，000個mRNA分子組成。特定類型的mRNA的量可以是每個細(xì)胞15-20，000拷貝。
圖1.mRNA結(jié)構(gòu)
如何從總RNA中分離mRNA
多項分子生物學(xué)技術(shù)，如cDNA文庫構(gòu)建、微陣列制備樣品制備、弱表達(dá)基因的北方印跡分析等。需要高質(zhì)量的mRNA。根據(jù)細(xì)胞類型，從總RNA中分離mRNA有兩種主要方法：直接分離mRNA的方法和減法分離mRNA方法。
mRNA分離的直接方法
從真核總RNA中分離成熟mRNA的原理涉及使用寡核苷酸dT（寡聚糖胸苷酸）對聚腺苷酸mRNA進(jìn)行親和選擇/親和色譜，寡核苷酸與poly（A）尾部互補(bǔ)。這是由于另外兩種類型的RNA中沒有poly（A）尾巴：tRNA和rRNA。
mRNA由30-200個腺嘌呤核苷酸組成。填充寡核苷酸dT/載體組合的親和柱用于從總RNA中分離mRNA。寡核苷酸dT/載體組合可以是纖維素結(jié)合的寡核苷酸dT、具有鏈霉親和素偶聯(lián)磁珠的生物素化寡核苷酸dT或寡核苷酸dT偶聯(lián)聚苯乙烯-乳膠珠。所有實(shí)驗(yàn)條件都應(yīng)處于無RNase的條件下，以防止RNA的酶分解。
圖2：親和色譜
總RNA應(yīng)溶解在高鹽緩沖液中，并短暫加熱至65-70°C以破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)。RNA分離的條件因市售的mRNA分離試劑盒而異。然而，聚（A）-RNA或mRNA的制備由三個步驟組成。
聚（A）-RNA與連接到載體的寡核苷酸dT分子的雜交
洗掉未結(jié)合的RNA
在低嚴(yán)格條件下從寡核苷酸-dT/載體組合中洗脫聚（A）-RNA
mRNA減法分離
基于寡核苷酸dT的mRNA純化僅產(chǎn)生具有poly（A）尾部或成熟真核mRNA的mRNA。因此，另一種稱為減法的方法可用于純化沒有poly（A）尾巴的mRNA。該方法可用于從酵母和細(xì)菌總RNA中分離mRNA。它還可用于從真核細(xì)胞中分離未成熟類型的mRNA以及成熟的mRNA。它涉及通過從總RNA中消耗大核糖體RNA來富集轉(zhuǎn)錄組。
總RNA與rRNA序列特異性5′生物素標(biāo)記寡核苷酸探針的雜交
去除rRNA/5′-生物素標(biāo)記的探針復(fù)合物以及鏈霉親和素包被的磁珠
雜質(zhì)純化和mRNA洗脫。
