Cyanine菁染料是近紅外熒光染料中最常用的一類(lèi)熒光染料，細(xì)胞和組織的自發(fā)熒光在近紅外波段最小，能提供更高的特異性和靈敏度，菁染料是二個(gè)非區(qū)域電荷的氮原子通過(guò)聚合搭橋的方式形成的一種分子

由于Cy染料的結(jié)構(gòu)式特點(diǎn)，他們往往有著極高的消選光系數(shù)，數(shù)值高達(dá)100,000 Lmol-1cm-1Cy系列的熒光染料我們一般分為磺酸化菁染料和非磺酸化菁染料non-sulfonated cyanines, and sulfonated cyanines.他們的光譜性質(zhì)基本相同，和蛋白 小分子修飾反應(yīng)也幾乎是一樣的，不同的在于他們的溶解性，非磺酸化菁染料是脂溶性的，磺酸化菁染料是水溶性的，結(jié)構(gòu)式上也會(huì)有些不同。

Cyanine5 NHS ester-藥物分子或小分子多肽用于小鼠活體成像實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)步驟如下：
SPF級(jí) BALB/C裸鼠，6～8 周齡, 18～20克, 實(shí)驗(yàn)前24 h 自由進(jìn)食、飲水。
于實(shí)驗(yàn)裸鼠腹腔內(nèi)注射2%300μL(215 mg/ kg)麻醉動(dòng)物。將裸鼠俯臥位平放于小動(dòng)物多光譜活體成像系統(tǒng)的記錄暗箱中。
實(shí)驗(yàn)時(shí)將Cy7 或Cy7 標(biāo)記的生物分子或藥物DMSO 稀釋后,于裸鼠尾靜脈注射200μL( 0.5 mg/g) [最佳用量和時(shí)間需要客戶根據(jù)自己的儀器和藥物試劑等條件優(yōu)化] ,每5min 記錄1張動(dòng)物在體內(nèi)發(fā)射熒光的成像圖片,分析熒光藥物的分布情況。對(duì)照鼠不注射藥物，進(jìn)行同時(shí)記錄。記錄結(jié)束后迅速解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、腎等臟器，進(jìn)行成像。
Cy7 檢測(cè)時(shí)激發(fā)波長(zhǎng)700～770 nm 帶通 ,發(fā)射波長(zhǎng)790 nm 長(zhǎng)通。液晶可調(diào)諧濾光片掃描范圍 780～950 nm ,掃描步進(jìn)10 nm。曝光時(shí)間為500 ms。
不同的藥物代謝時(shí)間不一樣，注射入裸鼠體內(nèi)，熒光立即分布全身，然后逐步向膀胱聚集，呈現(xiàn)顯著的腎排泄的特點(diǎn)一般4~6 小時(shí)，快得只有30 分鐘;如果是骨骼等部位靶點(diǎn)的Cy7 標(biāo)記藥物，有客戶反映一周后活體成像系統(tǒng)仍能檢測(cè)到熒光成像。
器官切片觀察：將解剖的器官迅速放置于4%固定4 小時(shí)以上，0%，20%，30%PBS 蔗糖依次沉底，20μm 切片，多聚賴(lài)氨酸洗過(guò)的載玻片貼片，晾干，DAPI 染色。共聚焦顯微鏡觀察，激光器為氦氖 633 nm。

（一）：Cyanine5 NHS ester和多克隆抗體的連接實(shí)驗(yàn)方法和步驟
【準(zhǔn)備材料】：
Cy3 NHS ester purchased from xi an ruixi bio
anti-GST多克隆抗體purchased from Abcam
【實(shí)驗(yàn)步驟】：

1. 在1 L 0.15 M NaCl 溶液中透析anti-GST抗體(濃度為 0.5 mL at 3 mg/mL)，常溫透析4小時(shí)。

2. 在4°C用新鮮的1 L 0.15 M NaCl 溶液再透析過(guò)夜。

3. 第二天用1 L 0.1 M NaHCO3 (pH 8.3)透析4小時(shí)。

4. 用0.22 μm注射器過(guò)濾頭過(guò)濾抗體溶液。

5. 用0.1 M NaHCO3 稀釋少量的抗體，在280nm處測(cè)其紫外吸收值計(jì)算標(biāo)記抗體的總量 (IgG antibody摩爾吸光系數(shù)170 000 M-1 cm-1 at 280 nm).

6. 用DMSO配置Cy3 NHS (MW 616.19) 溶液濃度為10 mg/mL; 計(jì)算所需體積以得到想要的Cy3 NHS 和抗體的比值(例如20:1)，然后慢慢將其加入到抗體溶液中，同時(shí)在暗處常溫緩慢攪拌45分鐘。

7. 用1 L 0.15 M NaCl 溶液常溫避光透析4小時(shí)除去未標(biāo)記上的Cy5。

8. 在4°C用新鮮的1 L 0.15 M NaCl 溶液再避光透析過(guò)夜。

9. 用1 L of 0.01 M PBS/ 0.01% 溶液常溫避光透析4小時(shí), 在4°C常溫避光再次透析過(guò)夜。

10. 用0.22 μm注射器過(guò)濾頭過(guò)濾抗體溶液。

11. 用0.01 M PBS/0.01 % 整數(shù)倍稀釋標(biāo)記抗體溶液，測(cè)量280nm(蛋白)和552nm(Cy)處的紫外可見(jiàn)吸光度。

12. 產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在0.01 M PBS/ 0.01% 溶液中，-20℃避光儲(chǔ)存。
    ?

F/P計(jì)算：
Cy3在552nm摩爾吸光系數(shù)為150 000 M-1 cm-1;此蛋白在280nm的摩爾吸光系數(shù)為170 000 M-1 cm-1;
不同蛋白的摩爾吸光系數(shù)不一樣;.Cy3 染料本身在280 nm 的吸收是552nm處的8%。按以下公式計(jì)算F/P
值。
[Cy3] = A552/150000
[antibody] = {A280 - (0.08×A552)}/170000
F/P final= [Cy3]/[antibody]= {1.13×A552}/ {A280 - (0.08×A552)}
?
（二）：Cyanine5 NHS ester和標(biāo)記 (D-ser2)-leucineenkephalin的連接實(shí)驗(yàn)方法和步驟
【準(zhǔn)備材料】：
Cy5 NHS ester purchased from xi an ruixi bio
(D-ser2)-leucineenkephalin purchased from sigma
【實(shí)驗(yàn)步驟】：

1. Cy5 NHS 1.0 mg 溶解于400 μL DMSO后，加入到1mL 的玻璃瓶中盛有(D-ser2)-leucine-enkephalinacetate (YSGFLT, 0.75 mg) 的400 μL DMSO溶液。(Dye 和peptide 投料比是 1:1)

2. 然后加入15 μL，常溫避光攪拌反應(yīng)混合物過(guò)夜。

3. 用HPLC 純化蛋白，使用蛋白C18柱子(25 cm×10 mm)，每次上樣注入2×400 μL，30分鐘梯度洗脫從0.1% TFA水溶液到MeCN∶H2O(0.1% TFA)=70∶30，流速4mL /min。(對(duì)不同的蛋白選擇不同的合適HPLC梯度流動(dòng)相)

4. 收集適當(dāng)?shù)纳珟Х?，?biāo)記多肽的保留時(shí)間比未標(biāo)記的多肽長(zhǎng)。

5. 產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光儲(chǔ)存;必要時(shí)可用質(zhì)譜表征。

6. CyDye標(biāo)記的蛋白穩(wěn)定性取決于蛋白本身。例如標(biāo)記的IgG在4 ℃可避光保存2月;更長(zhǎng)期的保存需加入等體積的甘油-20 ℃避光保存.

F/P計(jì)算：
Cy5 在650 nm 的摩爾吸光系數(shù)為250 000 M-1 cm-1 ，所用蛋白在280 nm處的摩爾吸光系數(shù)為 170
000 M-1 cm-1;Cy5在280nm處的吸收是650nm處的5%。按以下公式計(jì)算F/P值。
[Cy5 dye] = (A650)/250 000
[peptide] =[A280 -(0.05×A650)]/170 000
F/P final= [dye]/[peptide]= {0.68×A650}/ {A280 - (0.05×A650)}

Cyanine3 alkyne
Cy3 alkyne
Cyanine3 azide
Cy3 azide
Cy3 N3
Cyanine3 carboxylic acid? 1144107-76-5
Cy3 carboxylic acid
Cyanine3 hydrazide
Cyanine3 maleimide
Cy3 maleimide
Cyanine3 NHS ester?? 1032678-38-8
Cy3 NHS ester
Cyanine3.5 azide
Cyanine3.5 carboxylic acid? 1144107-79-8
Cyanine3.5 NHS ester
Cy3.5 NHS ester
Cyanine5 alkyne
Cyanine5 amine
Cy5 amine
Cy5 NH2
Cyanine5 azide
Cy5 N3
Cyanine5 Boc-hydrazide
Cyanine5 carboxylic acid
Cyanine5 hydrazide
Cyanine5 maleimide
Cy5 maleimide
Cyanine5 NHS ester? 1032678-42-4
Cy5 NHS ester
Cyanine5.5 alkyne
Cyanine5.5 azide
Cyanine5.5 carboxylic acid? 1144107-80-1
Cyanine5.5 maleimide
Cyanine5.5 NHS ester
Cyanine7 amine?? 1650635-41-8
Cy7 amine
Cy7 NH2
Cyanine7 azide
Cy7 azide
Cyanine7 carboxylic acid
Cyanine7 maleimide
Cy7 maleimide
Cyanine7 NHS ester
Cy7 NHS ester
Cyanine7.5 amine
Cyanine7.5 azide
Cyanine7.5 carboxylic acid?? 1686147-68-1
Cyanine7.5 maleimide
Cyanine7.5 NHS ester
Sulfo-Cyanine 5 NHS ester
Sulfo-Cy 5 NHS ester
Sulfo-Cyanine3 azide
Sulfo-Cy3 azide
Sulfo-Cyanine3 carboxylic acid
Sulfo-Cyanine3 maleimide
Sulfo-Cy3 maleimide
Sulfo-Cyanine3 NHS ester
Sulfo-Cy3 NHS ester
Sulfo-Cyanine5 alkyne
Sulfo-Cyanine5 azide
Sulfo-Cy5 azide
Sulfo-Cyanine5 carboxylic acid?? 1121756-16-8
Sulfo-Cyanine5 maleimide
Sulfo-Cy5 maleimide
Sulfo-Cyanine7 azide
Sulfo-Cyanine7 carboxylic acid
Sulfo-Cyanine7 NHS ester
Sulfo-Cy7 NHS ester

小編YQ2020.12