由于乳制品營(yíng)養(yǎng)豐富，為金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、克羅諾桿菌等食源性致病菌提供了良好的生長(zhǎng)環(huán)境，嚴(yán)重威脅乳制品相關(guān)的食品安全，因此對(duì)乳制品中食源性致病菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測(cè)是防治和檢測(cè)食源性致病菌工作中必不可少的環(huán)節(jié)。近年來(lái)，分子生物學(xué)、免疫學(xué)等檢測(cè)分析技術(shù)快速發(fā)展，相較于傳統(tǒng)致病菌檢測(cè)方法的繁瑣耗時(shí)，這些方法靈敏度高、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單，因而備受關(guān)注。

內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司趙淑環(huán)、王云霞、劉麗君、李翠枝*、呂志勇對(duì)近年來(lái)食源性致病菌檢測(cè)新技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對(duì)乳制品中食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)可能的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望，以期為乳制品中食源性致病菌快速檢測(cè)提供參考。

1?食源性致病菌傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)?

乳制品中常見(jiàn)的如金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、克羅諾桿菌等致病菌，在自然界中廣泛存在，可以通過(guò)乳制品加工人員、加工和運(yùn)輸過(guò)程污染乳制品，導(dǎo)致乳制品腐敗變質(zhì)和人類(lèi)食物中毒。按照傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，如GB 4789.10—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》、GB 4789.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》、GB 4789.30—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》和GB 4789.40—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn)》等，進(jìn)行增菌培養(yǎng)、選擇性分離、形態(tài)觀察、生理生化反應(yīng)、血清學(xué)鑒定等步驟需要耗時(shí)4～7 d，乳制品中的致病菌可被定性或定量檢出，但是菌株的分離和鑒別大多依靠肉眼觀察，主觀性強(qiáng)、準(zhǔn)確性低、檢驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜、靈敏度低，容易漏檢樣品中損傷或低劑量的致病菌，無(wú)法滿(mǎn)足快速檢測(cè)和預(yù)防致病菌污染的要求。因此，建立一種高特異性、準(zhǔn)確、快速的致病菌檢測(cè)方法對(duì)乳制品行業(yè)具有重要意義。

?2?食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)?

2.1??培養(yǎng)基顯色法

顯色培養(yǎng)基用于微生物的選擇性生長(zhǎng)和鑒別，已廣泛應(yīng)用于致病菌的篩選和鑒定。其基本原理是利用病原菌中含有的特異性酶進(jìn)行培養(yǎng)，將酶的特異性顯色底物添加到培養(yǎng)基中，在細(xì)菌生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的特異性酶分解特異性顯色底物后，目標(biāo)菌形成不同顏色的菌落，從而對(duì)目標(biāo)菌快速進(jìn)行分離和鑒別。該項(xiàng)技術(shù)是將現(xiàn)代化學(xué)合成技術(shù)、細(xì)菌代謝組學(xué)與目前尚不可替代的傳統(tǒng)方法相結(jié)合應(yīng)用于細(xì)菌檢驗(yàn)領(lǐng)域的一項(xiàng)新技術(shù)。

研究結(jié)果顯示，針對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和阪崎腸桿菌等細(xì)菌的顯色培養(yǎng)基在檢測(cè)細(xì)菌時(shí)，培養(yǎng)24 h?后，通過(guò)肉眼觀察菌落顏色即可對(duì)細(xì)菌進(jìn)行定性或定量分析，與傳統(tǒng)培養(yǎng)基相比，顯色培養(yǎng)基克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)基在各種細(xì)菌分離、鑒別、計(jì)數(shù)等操作過(guò)程中復(fù)雜、敏感性低和特異性差的缺點(diǎn)，能夠?qū)?xì)菌進(jìn)行快速篩查和鑒定。但在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，該技術(shù)因?yàn)橐恍└?jìng)爭(zhēng)菌的存在可能會(huì)抑制目標(biāo)菌的生長(zhǎng)，造成假陰性結(jié)果，所以顯色培養(yǎng)技術(shù)仍需與其他儀器或檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合使用，隨著未來(lái)對(duì)微生物特異性生化反應(yīng)機(jī)制研究的深入，將會(huì)促進(jìn)微生物顯色培養(yǎng)技術(shù)在食源性病原菌檢測(cè)領(lǐng)域的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

2.2??免疫法

免疫檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)具有快速、簡(jiǎn)單、有效和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，其高靈敏度、低成本的特點(diǎn)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的固有不足。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法、熒光免疫測(cè)定（fluorescence immunoassay，F(xiàn)IA）法、膠體金免疫層析（gold immunochromatographic assay，GICA）法和免疫磁珠分離（immunomagnetic separation，IMS）法等免疫學(xué)方法已廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的快速檢測(cè)。

ELISA法

ELISA是目前最常用的檢測(cè)方法，它利用酶標(biāo)記抗體與微生物細(xì)胞表面的特異性抗原發(fā)生特異反應(yīng)，加入酶底物后，由于催化作用底物顏色發(fā)生變化，所以可以被檢測(cè)到。ELISA法特異性好、效率高、成本低、檢出限可達(dá)ng甚至pg水平，并可制成試劑盒，適用于批量樣品的分析。乳制品病原微生物檢測(cè)中，ELISA法有效克服了現(xiàn)有傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法在檢測(cè)效率方面的缺陷，所用設(shè)備簡(jiǎn)單，在要求微量化、靈敏、便捷等的情況下，ELISA技術(shù)與其他技術(shù)相比也顯示出了極大優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)不可避免也存在一定的局限性，對(duì)抗體質(zhì)量的依賴(lài)性高，抗體的制備過(guò)程比較復(fù)雜，抗原表面決定簇類(lèi)似常會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，在微生物快檢技術(shù)發(fā)展中較為受限。

FIA法

FIA是免疫學(xué)中最早的技術(shù)之一，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，F(xiàn)IA具有檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在檢測(cè)食源性致病菌方面，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、彎曲桿菌和沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)。但是，目前FIA技術(shù)仍然存在一定的問(wèn)題和缺陷，F(xiàn)IA法僅包含形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)2?項(xiàng)指標(biāo)，病原微生物的常規(guī)檢測(cè)需要形態(tài)、生化等多方面綜合指標(biāo)，F(xiàn)IA技術(shù)在追求快速檢測(cè)的同時(shí)降低了指標(biāo)的多維性，檢驗(yàn)結(jié)果較為片面，在菌落形態(tài)相似時(shí)，因共同抗原容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

GICA法

GICA法是20世紀(jì)70年代逐漸建立起來(lái)的一種標(biāo)記技術(shù)，它是一種結(jié)合納米技術(shù)、免疫分析技術(shù)和色譜技術(shù)的固相標(biāo)記免疫分析技術(shù)，具有靈敏度高、性能穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、適用范圍廣、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可用于定性或半定量快速檢測(cè)大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌等食源性致病菌，是快速檢測(cè)領(lǐng)域極具發(fā)展?jié)摿Φ姆椒ㄖ?。在致病菌檢測(cè)過(guò)程中，與傳統(tǒng)生化鑒定分離方法比較，GICA法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、檢測(cè)速度快，適用于工廠生產(chǎn)前端，可在預(yù)防和即時(shí)監(jiān)測(cè)中發(fā)揮巨大的作用。

IMS法

IMS作為一種新的免疫學(xué)方法，是將免疫學(xué)的高度特異性與磁珠獨(dú)特的磁性相結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，涂于磁珠表面的抗體與樣品中的目標(biāo)物結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，在外部磁場(chǎng)的作用下，標(biāo)記復(fù)合體的磁珠進(jìn)行定向運(yùn)動(dòng)，將目標(biāo)物與樣品中的雜質(zhì)分離，從而達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)物的目的。IMS技術(shù)廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，適用于不同類(lèi)型的樣品檢測(cè)，與傳統(tǒng)的常規(guī)檢驗(yàn)方法相比具有顯著的優(yōu)勢(shì)，能從樣品中迅速、有選擇性地分離出目的微生物，有效減少背景干擾，提高檢測(cè)的精準(zhǔn)性，還能捕獲損傷的靶細(xì)菌，篩選結(jié)果可以與常規(guī)細(xì)菌生化方法聯(lián)用，也可以和顯色培養(yǎng)基、熒光PCR及微生物全自動(dòng)鑒定儀器等方法聯(lián)用，為食源性致病菌的檢測(cè)和鑒定提供有效的快速篩選手段。

2.3??分子生物學(xué)法

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，核酸檢測(cè)技術(shù)已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一，許多核酸檢側(cè)方法已應(yīng)用于食源性病原體的檢測(cè)，在食源性致病菌的檢測(cè)和鑒定中發(fā)揮著重要作用。目前常用的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)有PCR和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。

PCR技術(shù)

PCR是一種在體外選擇性擴(kuò)增DNA或RNA片段的常用分子生物學(xué)方法，由于其具有特異性強(qiáng)、靈敏性高、快速、簡(jiǎn)便、可擴(kuò)增RNA或cDNA、對(duì)起始材料質(zhì)量要求低等優(yōu)點(diǎn)，在食源性致病菌的快速檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用，如q-PCR、多重PCR技術(shù)等。

1）q-PCR技術(shù)。q-PCR是在普通PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入熒光團(tuán)，整個(gè)過(guò)程基于熒光信號(hào)的積累進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，在每個(gè)周期檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在計(jì)算機(jī)軟件中，通過(guò)計(jì)算每個(gè)樣品的循環(huán)閾值，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中待測(cè)成分進(jìn)行定量分析。根據(jù)熒光模式的不同，q-PCR可分為DNA染色法、熒光探針?lè)ê突瘜W(xué)引物試劑法，前2?種方法應(yīng)用較為廣泛。q-PCR按定量方法可分為絕對(duì)定量和相對(duì)定量，基于TaqMan探針的q-PCR技術(shù)可用于根據(jù)生物分布進(jìn)行成分定量分析，每個(gè)q-PCR板包含不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品和質(zhì)量控制樣品，用于目標(biāo)DNA拷貝的絕對(duì)定量。q-PCR方法已較為成熟，其配套儀器及試劑較為全面、試劑成本中等、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏性和特異性較高，但也存在一些缺點(diǎn)，如因目的基因發(fā)生突變而導(dǎo)致漏檢、低濃度模板的檢測(cè)結(jié)果無(wú)法確定、使用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量檢測(cè)時(shí)誤差較大等，精準(zhǔn)定量是q-PCR技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。

2）多重PCR技術(shù)。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)多種食源性致病菌的快速、同步檢測(cè)，一系列多靶點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，其中，多重PCR法因其高靈敏度和特異性而受到廣泛關(guān)注。多重PCR是在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入2?對(duì)以上的引物，然后連續(xù)擴(kuò)增出許多核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理、試劑和操作過(guò)程與傳統(tǒng)PCR相似。多重PCR是在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)定量檢測(cè)多種病原微生物，可以大大節(jié)省時(shí)間及試劑耗材，具有顯著的高效性和經(jīng)濟(jì)性。

3）數(shù)字PCR技術(shù)。隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，數(shù)字PCR技術(shù)也得到了發(fā)展，數(shù)字PCR技術(shù)中的“數(shù)字”是指單個(gè)實(shí)體中的信號(hào)切換，如關(guān)閉或打開(kāi)、激活或不激活、凝結(jié)或不凝結(jié)、熒光或非熒光等，數(shù)字PCR技術(shù)是繼普通PCR和q-PCR之后的第3代PCR技術(shù)，它是一種具有單分子靈敏度的精確核酸定量技術(shù)。相對(duì)于許多PCR，數(shù)字PCR方法更為高效、快速，它將傳統(tǒng)PCR與熒光探針技術(shù)相結(jié)合，將檢測(cè)樣品分為多個(gè)液滴，每個(gè)液滴上都有相同的PCR擴(kuò)增，含有熒光靶序列的微滴為陽(yáng)性，否則記為陰性，然后根據(jù)泊松分布統(tǒng)計(jì)樣品的DNA分子數(shù)目與比例，從而實(shí)現(xiàn)更靈敏的絕對(duì)定量，目前，數(shù)字PCR已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了牛乳中沙門(mén)氏菌的定量分析，檢測(cè)限為5 CFU/mL，具有顯著的定量?jī)?yōu)勢(shì)。目前，已建立了多種食源性病原菌的數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)方法，如大腸桿菌O157:H7、副溶血性弧菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等。

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增作為一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，其特點(diǎn)是反應(yīng)過(guò)程中溫度恒定，借助熱臺(tái)或水浴鍋等簡(jiǎn)單的恒溫儀器即可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，大大降低了成本和對(duì)精密溫控設(shè)備的依賴(lài)，已成為PCR擴(kuò)增的替代方案。與普通PCR相比，LAMP不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過(guò)程，縮短了檢測(cè)時(shí)間。但等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)存在的問(wèn)題是在細(xì)胞死亡后，從樣品中提取的死菌DNA同樣能作為模板進(jìn)行特異性擴(kuò)增，所以在檢測(cè)過(guò)程中因難以區(qū)分死菌和活菌會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

2.4???質(zhì)譜鑒定技術(shù)

質(zhì)譜技術(shù)是一種根據(jù)離子產(chǎn)生的質(zhì)譜圖確定樣品分子組成的分析技術(shù)，是一種新的微生物鑒定技術(shù)。質(zhì)譜技術(shù)不僅可以對(duì)傳統(tǒng)的目標(biāo)分析物進(jìn)行定性和定量分析，還可以用于快速、準(zhǔn)確的細(xì)菌鑒定，其原理是質(zhì)譜儀離子源通過(guò)電離作用賦予目標(biāo)菌高能量，目標(biāo)菌在吸收能量后被激發(fā)，產(chǎn)生強(qiáng)電離效率，載體進(jìn)入質(zhì)譜儀后，通過(guò)電壓的作用加速飛行，由于每個(gè)離子具有不同的質(zhì)荷比，而探測(cè)器上捕獲的帶電粒子所產(chǎn)生的信號(hào)信息也不同，細(xì)菌的鑒定可以通過(guò)與質(zhì)譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn)。質(zhì)譜法在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用具有明顯的優(yōu)勢(shì)，對(duì)樣品的要求很低，樣品可以不進(jìn)行分離純化，直接進(jìn)行測(cè)定，精確度高、操作簡(jiǎn)單、可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，同時(shí)還具有高靈敏度、高通量及高特異性，因此在微生物檢測(cè)方面得到了迅速發(fā)展。目前，質(zhì)譜技術(shù)已應(yīng)用于金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌等常見(jiàn)致病菌的分型和鑒定，與傳統(tǒng)方法相比分型和鑒定結(jié)果一致。

?3?結(jié)語(yǔ)?

綜上所述，傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)法仍是食源性致病菌檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但其操作復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)、主觀因素多等不足不能滿(mǎn)足乳制品行業(yè)現(xiàn)代化高速發(fā)展的需要。近些年涌現(xiàn)的顯色培養(yǎng)技術(shù)、免疫法、分子生物學(xué)法、質(zhì)譜鑒定技術(shù)等快速檢測(cè)技術(shù)，已在國(guó)內(nèi)外乳制品中得到廣泛運(yùn)用，但仍然無(wú)法滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，針對(duì)技術(shù)的靈敏度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性等方面仍存在較大的改進(jìn)空間。例如：1）培養(yǎng)基顯色技術(shù)因非目標(biāo)菌的競(jìng)爭(zhēng)作用和特異性酶反應(yīng)，常會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果假陰性和假陽(yáng)性，降低顯色培養(yǎng)基的靈敏性和特異性；2）免疫檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等諸多優(yōu)點(diǎn)，但非常依賴(lài)于抗體的好壞；且由于抗原表面決定簇類(lèi)似，常使結(jié)果發(fā)生交叉反應(yīng)；3）分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)操作步驟簡(jiǎn)單、快速、高效，但儀器設(shè)備昂貴，無(wú)法區(qū)分活、死致病菌，易造成假陰性結(jié)果；4）質(zhì)譜鑒定技術(shù)能夠快速、有效對(duì)致病菌進(jìn)行鑒定，但也存在一定的局限性，對(duì)微生物圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)依賴(lài)度高，需要不斷完善和更新微生物圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)。

隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和科學(xué)技術(shù)的更新，乳制品食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)還有很大的發(fā)展空間。研究人員應(yīng)加強(qiáng)對(duì)以下方面更為深入的探索：1）加強(qiáng)相關(guān)檢測(cè)技術(shù)和設(shè)備的研究，與時(shí)俱進(jìn)，積極創(chuàng)新多元化、智能化、便攜化和節(jié)約化檢測(cè)技術(shù)及檢測(cè)設(shè)備，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過(guò)程實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，大大提高食源性致病菌檢測(cè)效率，從而全面提升乳制品安全檢測(cè)與質(zhì)量檢測(cè)水平，有效控制食物中毒事件的發(fā)生，切實(shí)為人民群眾生命健康提供有力保障；2）在新型科學(xué)技術(shù)不斷涌現(xiàn)的當(dāng)下，還應(yīng)積極探索與元宇宙、人工智能、大數(shù)據(jù)、區(qū)塊鏈等新型創(chuàng)新技術(shù)的聯(lián)用，為乳制品行業(yè)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

本文發(fā)表于《乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)》2023年1期。
引文格式：
趙淑環(huán), 王云霞, 劉麗君, 等. 乳及乳制品中食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 乳業(yè)科學(xué)與技術(shù), 2023, 46(1): 62-67. DOI:10.7506/rykxyjs1671-5187-20220905-054. http://www.dairyst.net.cn
ZHAO Shuhuan, WANG Yunxia, LIU Lijun, et al. Progress in the application of techniques for rapid detection of foodborne pathogens in milk and dairy products[J]. Journal of Dairy Science and Technology, 2023, 46(1): 62-67. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/rykxyjs1671-5187-20220905-054. http://www.dairyst.net.cn

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