自噬研究指南|干貨篇：自噬檢測方法詳解
上期介紹了自噬的定義、過程和研究意義，要理解自噬生物學(xué)意義和潛在機(jī)制，檢測自噬活性至關(guān)重要。如何研究自噬，常用的自噬檢測方法有哪些，這些問題將在本期一一解答。
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1.?自噬研究經(jīng)典思路
一個清晰的研究思路是做研究的第一步，也是非常關(guān)鍵的一環(huán)，明確研究思路之后設(shè)計實(shí)驗(yàn)方案或是查找參考文獻(xiàn)才能事半功倍，自噬研究的常用思路可參考下圖。
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2.?自噬檢測方法
根據(jù)研究思路確定實(shí)驗(yàn)方案之后，自然是要選擇合適的研究工具。目前，檢測自噬水平的方法主要有三種：電鏡觀察、WB檢測和熒光蛋白標(biāo)記檢測。接下來將對這三種方法做詳細(xì)介紹。
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2.1透射電鏡
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自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，可使用透射電鏡可直接觀察自噬不同階段的形態(tài)變化，以初步判斷自噬階段（見表1），但無法進(jìn)行定量檢測。
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表1 自噬標(biāo)志及其形態(tài)特征
2.2 WB檢測標(biāo)志物
檢測與自噬小體膜結(jié)合的自噬體蛋白Atg8及其同源物的表達(dá)水平也是常用的自噬檢測方法。Atg8中，LC3B（通常簡稱為LC3）最先被發(fā)現(xiàn)并被廣泛使用。自噬形成時，胞漿型LC3（即LC3-I）會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-II），因此可利用WB檢測LC3-II/I比值的變化以評估自噬的強(qiáng)弱。此外自噬銜接物如sequestosome 1（SQSTM1，也稱為p62）也可用于檢測自噬，p62蛋白水平的多少與自噬強(qiáng)弱有著反比例關(guān)系。
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2.3熒光蛋白標(biāo)記檢測
2.3.1 GFP-LC3
利用綠色熒光蛋白（GFP）在酸性環(huán)境中淬滅的特性，研究人員開發(fā)出了GFP-LC3工具檢測自噬，可使用流式細(xì)胞儀定量檢測，但使用熒光顯微鏡檢測效果不夠理想。
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2.3.2 RFP-GFP-LC3
在GFP-LC3的基礎(chǔ)上，研究人員開發(fā)了GFP-RFP-LC3工具，紅色熒光蛋白（RFP）在酸性環(huán)境中信號穩(wěn)定。報告基因發(fā)出紅色和綠色的熒光，圖像重合時，自噬體將顯示黃光。然而，在自噬溶酶體的酸性環(huán)境中，GFP熒光迅速淬滅，只留下紅色熒光信號。誘導(dǎo)自噬后，黃光（表示更多的自噬體）和紅光（表示更多的自噬體）增加。然而，當(dāng)自噬流由于溶酶體抑制而減少時，黃光占比較高，這表明自噬體-溶酶體融合和/或在自噬溶酶體內(nèi)降解減少。當(dāng)自噬誘導(dǎo)受到抑制時，黃光和紅光均減少。
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2.3.3 GFP-LC3-RFP(-LC3ΔG)
細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的GFP-LC3-RFP-LC3ΔG融合蛋白經(jīng)Atg4內(nèi)肽酶加工，斷裂成GFP-LC3和RFP-LC3ΔG，后者缺乏與膜結(jié)合所需的C末端甘氨酸。GFP-LC3和RFP-LC3ΔG分別充當(dāng)自噬底物和內(nèi)對照。GFP-LC3相對于RFP-LC3ΔG的比值與自噬強(qiáng)弱呈負(fù)相關(guān)。這種方法可以使用流式細(xì)胞儀或熒光酶標(biāo)儀檢測自噬。
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2.3.4 Keima
Keima是一種獨(dú)特的熒光蛋白，在中性和酸性條件下分別在440 nm和550?nm處有兩個激發(fā)峰，在620 nm處有一個發(fā)射峰，這一特性使我們能夠監(jiān)測Keima從細(xì)胞質(zhì)到溶酶體的遞送。由于這是一種不依賴于Atg8的方法，Keima適用于監(jiān)測大量（非選擇性）自噬和小自噬，若Keima與細(xì)胞器標(biāo)記物融合，也可用于檢測細(xì)胞器自噬。
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表2 不同自噬檢測方法的原理和優(yōu)缺點(diǎn)
本期主要介紹了自噬檢測方法，并對各個檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)（見表2），實(shí)驗(yàn)中需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的方法。漢恒生物研發(fā)了多種LC3標(biāo)記的病毒，如GFP-LC3、RFP-GFP-LC3等，不僅可提供用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的慢病毒和腺病毒，還可提供用于動物實(shí)驗(yàn)的腺相關(guān)病毒。更多關(guān)于自噬檢測的問題，歡迎咨詢漢恒生物！
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參考文獻(xiàn)：
[1]Mizushima, Noboru., Murphy, Leon O.. ?Autophagy Assays for Biological Discovery and Therapeutic Development. Trends in biochemical sciences, 2020, 45(12):1080-1093.
