名詞解釋：

基因是核酸中貯存遺傳信息的遺傳單位，是貯存有功能的蛋白質多肽鏈或RNA序列信息及表達這些信息所必需的全部核苷酸序列。

基因組（gencme）：細胞或生物中，一套完整單倍體遺傳物質的總和（包括一種生物所需的全套基因及間隔序列）稱為基因組?；蚪M的功能是貯存和表達遺傳信息。

SD序列(Shine-Dalgarno sequence,SD sequence) 是mRNA能在細菌核糖體上產生有效結合和轉譯所需要的序列。SD序列與16S rRNA的3’末端堿基(AUUCCUCCAC-UAG-5’)互補，以控制轉譯的起始

分子克?。嚎寺。╟lone）：是指單細胞純系無性繁殖，現代概念是將實驗得到的人們所需的微量基因結構，引入適當的宿主細胞中去，在合適的生理環(huán)境中進行無性繁殖，從而利用宿主的生理機制繁衍人們所需要的基因結構，并進行表達。由于整個操作在分子水平上進行，所以稱為分子克?。╩olecular cloning）。

動物克隆(Animal cloning)就是不經過受精過程而獲得動物新個體的方法.

基因診斷：就是利用現代分子生物學和分子遺傳學的技術方法，直接檢測基因結構

（DNA水平）及其表達水平（RNA水平）是否正常，從而對疾病做出診斷的方法。

基因治療就是將有功能的基因轉移到病人的細胞中以糾正或置換致病基因的一種治療方法，是指有功能的目的基因導入靶細胞后有的可與宿主細胞內的基因發(fā)生整合，成為宿主細胞遺傳物質的一部分，目的基因的表達產物起到對疾病的治療作用。

轉基因動物就是把外源性目的基因導入動物的受精卵或其囊胚細胞中，并在細胞基因組中穩(wěn)定整合，再將合格的重組受精卵或囊胚細胞篩選出來，采用借腹懷孕法寄養(yǎng)在雌性動物（foster mother）的子宮內，使之發(fā)育成具有表達目的基因的胚胎動物，并能傳給下一代。這樣，生育的動物為轉基因動物。

探針：在核酸雜交分析過程中，常將已知順序的核酸片段用放射性同位素或生物素進行標

記。這種帶有一定標記的已知順序的核酸片段稱為探針。

限制性核酸內切酶：限制性核酸內切酶（restriction endonuclease）是一類專門切割DNA的酶，它們能特異結合一段被稱為限制酶識別順序的特殊DNA序列并切割dsDNA。

載體：要把一個有用的基因（目的基因-研究或應用基因）通過基因工程手段送到生物細胞（受體細胞），需要運載工具攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。

限制性片段長度多肽性分析(RFLP):DNA片段長度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymer-phism,RFLP）基因突變導致的基因堿基組成或(和)順序發(fā)生改變,會在基因結構中產生新的限制性內切酶位點或使原有的位點消失. 用限制酶對不同個體基因組進行消化時，其電泳條帶的數目和大小就會產生改變，根據這些改變可以判斷出突變是否存在。

簡答題：

1.蛋白質的生物合成過程中的成分參與，參與因子，作用？

mRNA是合成蛋白質的“藍圖（或模板）” ?????tRNA是原料氨基酸的“搬運工”

rRNA與多種蛋白質結合成核糖體作為合成多肽鏈的裝配機（操作臺）

tRNA

mRNA是合成蛋白質的藍圖，核糖體是合成蛋白質的工廠，但是，合成蛋白質的原料——20種氨基酸與mRNA的堿基之間缺乏特殊的親和力。因此，需要轉運RNA把氨基酸搬運到核糖體中的mRNA上

rRNA

核糖體RNA（rRNA）和蛋白質共同組成的復合體就是核糖體，核糖體是蛋白質合成的場所。

核糖體的大小亞基在行使翻譯功能即肽鏈合成時聚合成整體，為蛋白質的合成提供場所。

mRNA

攜帶遺傳信息，在蛋白質合成時充當模板的RNA。 ?從脫氧核糖核酸（DNA）轉錄合成的帶有遺傳信息的一類單鏈核糖核酸（RNA）。它在核糖體上作為蛋白質合成的模板，決定肽鏈的氨基酸排列順序。

核糖體：

容納mRNA，并能沿著mRNA由5’——3’ 移動，由tRNA解讀其密碼；氨基酰位點（A位點），可結合氨基酰-tRNA（AA-tRNA）；肽?；稽c（P位點），可結合肽?；?tRNA（肽-tRNA）；

肽?；D移酶中心，是形成肽鍵的位點等。

起始因子（IF）:翻譯起始所需要的催化性蛋白質。促使核糖體和mRNA正確結合?

延伸因子（EF）:蛋白質合成過程，幫助進入的氨基酸殘基與肽鏈之間形成酰基，使肽鏈得以延長的一類蛋白質因子。

釋放因子（RF）：識別終止密碼子引起完整的肽鏈和核糖體從mRNA上釋放的蛋白質?

翻譯起始時，第一個氨基酸一般是蛋氨酸，其氨基要甲?；?，予以保護。氨基酰tRNA進入A位肽鍵的形成蛋白質合成的終止肽鏈的延伸

2.核酸技術

（1）PCR技術的基本原理：

PCR技術在模板DNA、dNTP、Mg2+、合適Buffer等條件下，用耐熱的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，經過DNA變性、引物與模板結合（復性）和延伸3個步驟的反復循環(huán)（25～30次）過程，使目的DNA呈指數擴增。

DNA模板的熱變性：將待擴增DNA加熱到94℃左右，使雙鏈DNA解開成為單鏈，并

游離于反應體系中作為模板。

模板與引物的結合（退火或復性）：將體系溫度降至合適溫度（52℃左右），使加

入的引物與模板DNA兩端（3ˊ端）堿基序列互補結合。

引物延伸：將體系溫度升到72℃左右，Taq聚合酶催化dNTP按堿基互補原則連接在

DNA引物3ˊ端，使鏈延伸，形成兩條與模板互補的新鏈。

參數

變性溫度與時間：一般選擇： 94℃，30秒

退火溫度與時間：取決于引物長度、濃度和G+C含量，一般選擇為Tm - 5℃

延伸溫度與時間：一般選擇： 70℃ ～75℃

循環(huán)次數：取決于模板濃度， 一般循環(huán)：30次

[引物是根據已知序列的模板DNA待擴增區(qū)兩端而設計的一對寡核苷酸小片斷，長度一般為15～30個堿基。

RNA作為模板時，需要：RNA cDNA PCR, 稱此為RT-PCR]

（2）Southem印跡雜交法(Southern blot hybridization)

又稱為Southern雜交，即DNA-DNA雜交分析。是研究DNA圖譜的基本技術，主要用于基因組DNA的分析，如在基因組中特異基因的定位及檢測等，亦可用于分析重組質粒和噬菌體。在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產物分析等方面有重要價值。

提取DNA→限制性內切酶酶切→瓊脂糖凝膠電泳→DNA用堿變性→變性的DNA轉移

到硝酸纖維素膜→加入DNA探針→顯影或顯色檢測雜交信號→證實DNA靶分子是

否含有目的基因片段。

???Northem印跡雜交法(Northern blot hybridization)

又稱為Northern雜交，即RNA-DNA雜交分析。是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上的方法。主要用于檢測某一組織或細胞中已知的特異mRNA的表達水平以及比較不同組織和細胞的同一基因的表達情況。

（1）檢測mRNA長度分子量大?。ㄒ离娪具w移率估計）；

（2）mRNA的含量，即基因表達高低。（密度掃描儀，定量分析）

Northern雜交用于鑒定RNA。其基本原理與Southern雜交相同，只不過變件方法不能采用堿變性法，因為堿導致RNA水解，一般采用聚乙二醛和二甲基亞礬、甲醛、甲基氫氧化汞等變性方法。

[分子印跡技術-特點

1.預定性，即它可以根據不同的目的制備不同的MIPs，以滿足各種不同的需要。 　　

2.識別性，即MIPS是按照模板分子定做的，可專一地識別印跡分子。 　　

3.實用性，即它可以與天然的生物分子識別系統(tǒng)如酶與底物、抗原與抗體、受體與激素相比擬，但由于它是由化學合成的方法制備的，因此又有天然分子識別系統(tǒng)所不具備的抗惡劣環(huán)境的能力，從而表現出高度的穩(wěn)定性和長的使用壽命.]

（3）DNA測序（雙脫氧法原理）

原理利用了DNA聚合酶所具有的兩種催化反應特性：第一，DNA聚合酶能以單鏈DNA

為模板，準確合成出DNA的互補鏈；第二，DNA聚合酶能以2′,3′-雙脫氧核苷三磷酸

為底物，使之參入到寡核苷酸鏈的3′-末端，從而終止DNA鏈的延長。[在測序用的緩沖液中含有四種dNTP及聚合酶. 測序時分成四個反應, 每個反應除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的A, C, G, T核苷三磷酸(稱為ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 然后進行聚合反應. 在第一個反應物中, ddATP會隨機地代替dATP參加反應一旦ddATP加入了新合成的DNA鏈, 由于其3位的羥基變成了氫, 所以不能繼續(xù)延伸. 所以第一個反應中所產生的DNA鏈都是到A就終止了; 同理第二個反應產生的都是以C結尾的; 第三個反應的都以G結尾, 第四個反應的都以T結尾, 電泳后就可以讀出序列了]

3.基因表達的特點（時空特異性）

基因表達(gene expression)是指基因的遺傳信息經過轉錄、轉譯等極其復雜的生物化學反應，最終產生具有生物功能的蛋白質的過程，即DNA→RNA→蛋白質。

基因表達是受調控的

時間特異性

按功能需要，某一特定基因的表達嚴格按特定的時間順序發(fā)生，稱之為基因表達的時間特異性(temporal specificity)。多細胞生物基因表達的時間特異性又稱階段特異性(stage specificity)。

空間特異性

基因表達伴隨時間順序所表現出的這種分布差異，實際上是由細胞在器官的分布決定的，所以空間特異性又稱細胞或組織特異性(cell or tissue specificity)。在個體生長全過程，某種基因產物在個體按不同組織空間順序出現，稱之為基因表達的空間特異性(spatial specificity)。

4.分子克?。?/p>

(1)?典型的基因重組（切，接，轉，增，檢）

應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子——復制子，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA ?。

① DNA的體外重組（切、接）② 重組DNA分子的轉化和篩選（轉、增）③ 轉化子的篩選和鑒定（檢）

載體和目的基因的分離；載體和目的基因的切割；載體和目的基因的重組；重組DNA的轉化和擴增；重組DNA的篩選和鑒定。

"分"是指分離制備合格的待操作的DNA，包括作為運載體的DNA和欲重組的目的DNA（① 直接分離目的基因；② 通過化學合成法和PCR（聚合酶鏈式反應）擴增法（又稱酶促合成法）獲得基因；③ 通過構建cDNA文庫或基因組文庫，從中篩選目的基因）；"切"是指用序列特異的限制性核酸內切酶切割載體和目的基因；"接"是指用DNA連接酶將目的DNA同載體DNA連接起來，形成重組的DNA分子；"轉"是指通過特殊的方法（原生質轉化法、化學轉化法、電穿孔轉化法）將重組的DNA分子送入宿主細胞中，使原來細胞的遺傳基因和遺傳性發(fā)生相應變化的現象，“增”進行復制和擴增；"檢"則是從宿主群體中通過方法（抗生素抗性篩選、β-半乳糖苷酶插入失活型篩選、營養(yǎng)缺陷型篩選、原位雜交法篩選、Southern印跡法篩選、限制性酶切法篩選、蛋白質生物學功能法篩選、免疫沉淀法篩選、聚丙烯酰胺凝膠電泳法篩選）挑選出攜帶有重組DNA分子的個體。

?(2)DNA分子體外連接技術

?黏性末端DNA片段的連接

DNA連接酶能夠催化外源DNA和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組的DNA分子。應用

DNA連接酶可在體外將具有黏性末端的DNA限制片段，插入到適當的載體分子上，從而可能按照人們的意圖構建出新的DNA雜種分子

平頭末端DNA片段的連接

T4DNA連接酶法：可以催化粘端或平端雙鏈DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之間以磷酸二酯鍵結合，該催化反應需ATP作為輔助因子。

同聚物加尾法：應用末端脫氧核苷酸轉移酶，能夠將核苷酸加到DNA分子單鏈延伸末端的3’ -OH基團上，它并不需要模板鏈的存在，它一個一個加上核苷酸，構成由核苷酸組成的尾巴。需用5’特異的核酸外切酶處理平末端的DNA分子上產生帶5’ -OH的單鏈延伸。

化學合成的銜接物連接DNA分子：銜接物(1inker)，是指用化學方法合成的一段由10-12個核苷酸組成的，具有一個或數個限制酶識別位點的寡核苷酸片段。

?(3)藍白斑篩選原理

β-半乳糖苷酶插入失活型篩選

載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達產物能使細胞產生顏色反應，從而易于辨認和篩選，當有外源基因插入該顯色基因后，其顯色反應消失?！舅{白篩選原理：某些質粒帶有大腸桿菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因區(qū)外又另外引入了一段含多種單一限制酶位點的DNA序列。這些位點上如果沒有克隆外源性DNA片段，在質粒被導入lac-的大腸桿菌后，質粒攜帶的半乳糖苷酶基因將正常表達，與大腸桿菌的半乳糖苷酶基因互補，產生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和誘導劑IPTG后，出現藍色的菌落。如果在多克隆位點上插入外源DNA片段，將使lac Z基因滅活，不能生成半乳糖苷酶，結果菌落出現白色。由于這種顏色標志，重組克隆和非重組克隆的區(qū)分一目了然?！?/p>

（4）工具酶是什么？常用的工具酶有哪些？

工具酶（tool enzymes） ：指能用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、反轉錄等有關的各種酶系統(tǒng)。

工具酶的種類:

①
?限制性核酸內切酶（restriction endonadease)【Ⅰ、Ⅲ型它們識別與切割順序不在一個地方，不產生特異性的DNA片段，與基因工程意義不大。Ⅱ型也就是基因工程說到的限制酶核酸內切酶，Ⅱ型酶分子量小，僅需Mg2+作為催化反應的輔因子，識別與切割位點相同，產生特異的DNA片段。同裂酶:指來源不同但識別相同靶序列的核酸內切酶。同裂酶進行同樣的切割，產生同樣的末端。但有些同裂酶對甲基化位點的敏感性不同。同尾酶:指來源不同、識別靶序列不同但產生相同的粘性末端的核酸內切酶】、② DNA連接酶（DNA ligase)【催化有互補順序的兩個dsDNA分子的粘性末端或平頭末端3′-OH、5′-P連接作用。】、③逆轉錄酶(reverse transcriptase)[逆轉錄酶是一種多功能酶，它的酶活性有：逆轉錄酶：以mRNA為模板合成cDNA；DNA依賴DNApol：以ssDNA為模板，3-OH DNA片段為引物，合成DNA鏈。RnaseH ：外切RNA酶活性，底物是RNA－DNA雜交分子RNA鏈，有兩種：①5′→3′外切RNA，稱5′→3′外切RNA酶；② 3′→5′外切RNA，稱3′→5′外切RNA酶，也稱RnaseH。]、④DNA聚合酶(DNA polymerase)[① 5 ’ →3 ’聚合活性；② 3 ’ →5 ’外切酶活性；③ 在無dNTP時，可以從任何3 ’ -OH端外切；④ 在只有一種dNTP時，外切至互補核苷暴露時為止；⑤ 在有4種dNTP均存在時，聚合酶活性占主導地位。]、⑤核酸酶(nuclease)[① 降解ssDNA或ssRNA形成5’p末端的單或寡核苷酸，對DNA活性強于>RNA;② 中量S1可從切口或小缺口處降解dsDNA;③ 極大量的S1才能降解dsDNA或DNA-RNA雜交鏈，原因是后者對S1降解有抗性，所以S1又稱單鏈特異的核酸酶。]、⑥末端轉移酶[① 催化一個單核酸（dNTP）加到另一個DNA分子的3’－OH末端；② 平端或帶延伸3’－OH末端的dsDNA需要Co2＋存在才能作模板，](terminal transferase)、⑦堿性磷酸酶[① 去除DNA、RNA和dNTP的5’磷酸根；② 去除5’p ，防止DNA片段或載體自身環(huán)化。③ 32p標記5’p末端前，先用其去除DNA或RNA上的5’p](BAP或CIP)。

（5）在分子克隆中要作為載體需要哪些條件？

要把一個有用的基因（目的基因-研究或應用基因）通過基因工程手段送到生

物細胞（受體細胞），需要運載工具攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載

工具就叫做載體（vector）

載體所具備的特征① 能在宿主細胞中大量復制，得到大量的重組DNA分子；② 載體上的內切酶位點對于一種酶來說只能有一個（置換型載體上被置換片段的兩側各有一個內切酶位點）；③ 克隆載體要有復制起點，表達載體要有啟動子④ 載體上要有報告基因或選擇標記基因⑤ 在不影響載體復制和表達的DNA序列上有內切酶酶切位點⑥ 具有較高的外源DNA裝載能力。

5.限制性核酸內切酶3’5’端的標記，再用DNA聚合酶聚合，末端有何變化？再用DNA連接酶連接，再酶切，是否能形成相同的末端？

Ⅱ型酶識別的特殊DNA序列稱為限制酶的識別位點（或切割位點）。它能識別dsDNA的4~6bp的回文序列并水解該部分的核苷鍵。一般來說是4~6bp，有6個以上的，但沒有4個以下的。識別順序呈二重對稱，即180°旋轉對稱。

形成平頭末端（bluntend）PvuⅡⅠ等形成的平頭末端

粘性末端（sticky end）：限制酶切割產生2個突出的末端稱之，作用是放在一起自發(fā)形成雙鏈。

6.應用（判斷動物功能，DNA分子體外重組，體外表達的過程）

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