分子生物學(xué)

第一章 緒論

分子生物學(xué)研究?jī)?nèi)容有哪些方面？

1、結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)； 2、基因表達(dá)的調(diào)節(jié)與控制； 3、DNA重組技術(shù)及其應(yīng)用； 4、結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)、生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)

第二章DNA and Chromosome

1、DNA的變性：在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。

2、DNA復(fù)性：變性DNA在適當(dāng)條件下，分開的兩條單鏈分子按照堿基互補(bǔ)原則重新恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象的現(xiàn)象。

3、Tm(熔鏈溫度)： DNA加熱變性時(shí)，紫外吸收達(dá)到最大值的一半時(shí)的溫度，即DNA分子內(nèi)50%的雙鏈結(jié)構(gòu)被解開成單鏈分子時(shí)的溫度）

4、退火：熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，稱為退火

5、假基因：基因組中存在的一段與正?；蚍浅Ｏ嗨频荒鼙磉_(dá)的DNA序列。以Ψ來表示。

6、C值矛盾或C值悖論:C值的大小與生物的復(fù)雜度和進(jìn)化的地位并不一致，稱為C值矛盾或C值悖論(C-Value Paradox)。

7、轉(zhuǎn)座：可移動(dòng)因子介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)的重排現(xiàn)象。

8、轉(zhuǎn)座子：染色體、質(zhì)粒或噬菌體上可以轉(zhuǎn)移位置的遺傳成分

9、DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)：1）DNA分子是由兩條相互平行的脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤繞而成；2）DNA分子中的脫氧核苷酸和磷酸交替連接，排在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架，堿基排列在外側(cè)；3）

DNA分子表面有大溝和小溝；4）兩條鏈間存在堿基互補(bǔ)，通過氫鍵連系，且A=T、G ≡ C（堿基互補(bǔ)原則）；5）螺旋的螺距為3.4nm，直徑為2nm，相鄰兩個(gè)堿基對(duì)之間的垂直距離為0.34nm，每圈螺旋包含10個(gè)堿基對(duì)；6）堿基平面與螺旋縱軸接近垂直，糖環(huán)平面接近平行

10、真核生物基因組結(jié)構(gòu)：編碼蛋白質(zhì)或RNA的編碼序列和非編碼序列，包括編碼區(qū)兩側(cè)的調(diào)控序列和編碼序列間的間隔序列。

特點(diǎn)：1）真核基因組結(jié)構(gòu)龐大 哺乳類生物大于2X109bp；2）單順反子（單順反子：一個(gè)基因單獨(dú)轉(zhuǎn)錄，一個(gè)基因一條mRNA，翻譯成一條多肽鏈；）3）基因不連續(xù)性 斷裂基因（interrupted gene）、內(nèi)含子(intron)、 外顯子(exon)；4）非編碼區(qū)較多，多于編碼序列(9:1) 5）含有大量重復(fù)序列

11、Histon(組蛋白)特點(diǎn)：極端保守性 、無組織特異性、 氨基酸分布的不對(duì)稱性、可修飾作用、 富含Lys的H5

12、核小體組成： 由組蛋白和200bp DNA組成

13、轉(zhuǎn)座的機(jī)制：轉(zhuǎn)座時(shí)發(fā)生的插入作用有一個(gè)普遍的特征，那就是受體分子中有一段很短的被稱為靶序列的DNA會(huì)被復(fù)制，使插入的轉(zhuǎn)座子位于兩個(gè)重復(fù)的靶序列之間。

復(fù)制型轉(zhuǎn)座：整個(gè)轉(zhuǎn)座子被復(fù)制，所移動(dòng)和轉(zhuǎn)位的僅為原轉(zhuǎn)座子的拷貝。

非復(fù)制型轉(zhuǎn)座：原始轉(zhuǎn)座子作為一個(gè)可移動(dòng)的實(shí)體直接被移位。

第三章 DNA Replication and repair

1、 半保留復(fù)制：DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對(duì)規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。

2、 復(fù)制子：生物體內(nèi)能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位

3、 前導(dǎo)鏈：以復(fù)制叉移動(dòng)的方向?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)，一條模板鏈的走向是3’→5’， 子代鏈復(fù)制時(shí)以5’→3’方向連續(xù)合成，這一條鏈稱為前導(dǎo)鏈

4、 滯后鏈：另一條模板鏈的走向是5’→3’， 子代鏈通過不連續(xù)的5ˊ-3ˊ聚合而成，稱為滯后鏈(lagging strand)。

5、 岡崎片段：滯后鏈的合成是一段一段的。DNA復(fù)制時(shí)，由滯后鏈所形成的子代DNA短鏈稱為岡崎片段

6、 端粒:是真核生物線性染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，含物種特異性（species-specific）的DNA重復(fù)序列。

7、 逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板, 按照RNA中的核苷酸順序合成DNA的過程，稱為反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription, RT)。該過程由逆轉(zhuǎn)錄酶催化進(jìn)行，亦稱反轉(zhuǎn)錄

8、 DNA復(fù)制的主要特征：半保留復(fù)制、 雙向復(fù)制、 半不連續(xù)復(fù)制、 保真性

9、 DNA復(fù)制的幾種方式：

10、 DNA polymerases（DNA聚合酶） in E. Coli及其主要功能

DNA Pol Ⅳ：din B編碼

DNA Pol Ⅴ：umc C, umc D編碼

兩者涉及DNA的錯(cuò)誤傾向修復(fù) (error-prone repair)。當(dāng)DNA受到較嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，即可誘導(dǎo)產(chǎn)生這兩個(gè)酶，使修復(fù)缺乏準(zhǔn)確性（accuracy)，因而出現(xiàn)高突變率。高突變率雖會(huì)殺死許多細(xì)胞，但至少可以克服復(fù)制障礙，使少數(shù)突變的細(xì)胞得以存活。

11、 單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）：在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。其作用是保證被解鏈酶解開的單鏈在復(fù)制完成之前能保持單鏈結(jié)構(gòu)。

12、 常見的真核細(xì)胞DNA聚合酶及其功能

13、 原核生物DNA復(fù)制的過程（課本P50-P52）

1）復(fù)制的起始：識(shí)別起始點(diǎn)，合成引發(fā)體：在E.coli，DnaA蛋白識(shí)別并結(jié)合ori， DnaC 協(xié)助DnaB蛋白（解鏈酶, helicase）結(jié)合于ori ，DNA雙鏈局部被打開，引物酶及其他蛋白加入，形成引發(fā)體。

形成單鏈：促旋酶（II型拓?fù)洚悩?gòu)酶）解開DNA超螺旋，解鏈酶解開雙鏈，單鏈結(jié)合蛋白SSB結(jié)合于處于單鏈狀態(tài)模板鏈上。

合成引物：前導(dǎo)鏈 的引物由RNA聚合酶合成，滯后鏈的引物由引發(fā)酶合成 。引物提供3’-OH，復(fù)制進(jìn)入延伸階段

2）復(fù)制的延伸：按照與模板鏈堿基配對(duì)的原則，在DNA聚合酶III的作用下，逐個(gè)加入脫氧核糖核酸，使鏈延長(zhǎng)。

DNA聚合酶的即時(shí)校讀和堿基選擇功能，確保復(fù)制的保真性。

由于DNA雙鏈走向相反，DNA聚合酶只能催化核苷酸從5’→3’方向合成，前導(dǎo)鏈的復(fù)制方向與解鏈方向一致，可以連續(xù)復(fù)制，而另一模板鏈沿5’→3’方向解開，隨從鏈（滯后鏈）的復(fù)制方向與解鏈方向相反，復(fù)制只能在模板鏈解開一定長(zhǎng)度后進(jìn)行，因此隨從鏈的合成是不連續(xù)的，形成的是若干個(gè)崗崎片段。 DNA聚合酶I的3’-5’核酸外切酶活性去除RNA引物。DNA聚合酶I填補(bǔ)DNA間隙。連接酶使相鄰兩個(gè)DNA片段的3’-OH末端和5’-P末端形成3’，5’磷酸二酯鍵。

3）復(fù)制的終止：兩個(gè)復(fù)制叉的匯合點(diǎn)就是復(fù)制的終點(diǎn)。兩個(gè)復(fù)制叉向前推移，在終止區(qū)相遇而停止復(fù)制，復(fù)制體解體

14、DNA復(fù)制過程中后隨鏈的合成：后隨鏈開始合成DNA時(shí)，需要一段RNA引物、后隨鏈的引發(fā)過程引發(fā)體來完成引發(fā)體像火車頭一樣在后隨鏈分叉的方向上前進(jìn)，并在模板上斷斷續(xù)續(xù)地引發(fā)生成后隨鏈的引物RNA短鏈，再由DNA聚合酶III作用合成DNA，直到遇到下一個(gè)引物或?qū)槠螢橹?。由RNaseH降解RNA引物并由DNA聚合酶I將缺口補(bǔ)齊，再由DNA連接酶將兩個(gè)岡崎片段連接在一起形成大分子DNA。

15、與原核生物相比真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)：DNA復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞周期的S期；

染色體DNA有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，為多復(fù)制子；

岡崎片段長(zhǎng)約100—200 bp。

每個(gè)復(fù)制子在染色體DNA全部復(fù)制完成前，不能再開始新一輪復(fù)制；而在快速生長(zhǎng)的原核中，起點(diǎn)可以連續(xù)發(fā)動(dòng)復(fù)制。真核生物快速生長(zhǎng)時(shí)，往往采用更多的復(fù)制起點(diǎn)。

復(fù)制叉移動(dòng)速度較原核生物慢（1/20）；

真核生物線性染色體兩端有端粒結(jié)構(gòu)，防止染色體間的末端連接和核酸酶降解。由端粒酶負(fù)責(zé)新合成鏈5￠端RNA引物切除后的填補(bǔ)，保持端粒的一定長(zhǎng)度。

16、幾種修復(fù)機(jī)制：

1）直接修復(fù) 2）錯(cuò)配修復(fù)3）切除修復(fù) 4）重組修復(fù) 5)SOS修復(fù)

第四章 轉(zhuǎn)錄

概念：模板鏈與編碼鏈：DNA雙鏈中按堿基配對(duì)規(guī)律能指引轉(zhuǎn)錄生成RNA的一股單鏈，稱為模板鏈(template strand)，也稱作有意義鏈或Watson鏈。相對(duì)的另一股單鏈是編碼鏈(coding strand)，也稱為反義鏈或Crick鏈。

啟動(dòng)子：RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。

終止子（terminator）：提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列。

終止因子(termination factor) ：協(xié)助RNA聚合酶識(shí)別終止信號(hào)的輔助因子（蛋白質(zhì)）。

外顯子&內(nèi)含子：不編碼的插入序列，稱內(nèi)含子；編碼的序列稱外顯子。

斷裂基因： 大多數(shù)真核生物基因的核苷酸順序不全部反映到蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)上?；虻木幋a序列被不編碼的插入序列分割成幾段，這樣的基因稱為斷裂基因。

RNA編輯：mRNA分子由于核苷酸的缺失、插入或置換導(dǎo)致序列發(fā)生了不同于模板DNA的變化，這種現(xiàn)象稱為RNA編輯。

RNA聚合酶組成: 1)原核生物——2個(gè)α亞基、1個(gè)β亞基、1個(gè)次β亞基、1個(gè)ω亞基、1個(gè)σ亞基構(gòu)成RNA聚合酶的全酶。 2）真核生物——一般有8-16個(gè)亞基，有兩個(gè)分子質(zhì)量超過100000的大亞基，同種生物3類聚合酶（聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）有共享小亞基的傾向即有幾個(gè)小亞基是3類或2類聚合酶所共有的。

σ70 識(shí)別的啟動(dòng)子：E. coli中σ70 識(shí)別的啟動(dòng)子包含2個(gè)保守的核心序列-10 區(qū) 和-35 區(qū) ：

-10 區(qū) (TATA box, Pribnow box)

中心位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游10bp處，一致序列(Consensus sequence)為T80A95T45A60A50T96, 所以稱-10 區(qū)。(右下角的數(shù)字表示該堿基在這個(gè)位置出現(xiàn)的百分率）

功能：與RNA聚合酶緊密結(jié)合；形成開放啟動(dòng)子復(fù)合體；使RNA聚合酶定向轉(zhuǎn)錄

-35 區(qū) (Sextama box)

中心位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游35bp處，一致序列為T82T84G78A65C54A45。

功能： RNA聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)，為轉(zhuǎn)錄選擇模版； -10 區(qū) 和-35 區(qū) 距離相當(dāng)穩(wěn)定，過大過小會(huì)影響轉(zhuǎn)錄活性

轉(zhuǎn)錄的基本過程：起始(initiation)、延伸(elongation)、終止(termination）。

終止子的2個(gè)類型 ：強(qiáng)終止子（內(nèi)部終止子）——不依賴于ρ因子

弱終止子——依賴于ρ因子

真核生物中的三種RNA聚合酶存在部位及作用

酶 位置 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 相對(duì)活性 對(duì)α-鵝膏蕈堿的敏感性

RNA聚合酶Ⅰ 核仁 rRNA 50-70% 不敏感

RNA聚合酶Ⅱ 核質(zhì) hnRNA 20-40% 敏感

RNA聚合酶Ⅲ 核質(zhì) tRNA 約10% 存在物種特異性

真核生物mRNA 加工

5’ capping（ 5’ 加帽）

3’ polyadenylation（ 3’ 加poly A尾巴）

splicing（拼接）

primary product（原初產(chǎn)物）: hnRNA ( intron, exon)

RNA editing（編輯）

modification（修飾）

原核和真核細(xì)胞的 mRNA 的異同

同：功能相同，即通過三聯(lián)密碼子翻譯生成蛋白質(zhì)

異：1）真核細(xì)胞5'端存在帽子結(jié)構(gòu)；絕大多數(shù)具有多尾巴； 2）原核細(xì)胞：mRNA半衰期短；許多原核生物mRNA可能以多順反子的形式存在；5'端無帽子結(jié)構(gòu)，3’端沒有或只有較短的多（A）結(jié)構(gòu)

第五章 翻譯

密碼子：在mRNA的開放閱讀框架區(qū)，以每3個(gè)相鄰的核苷酸為一組，代表一種氨基酸(或其他信息)，這種三聯(lián)體形式的核苷酸序列稱為密碼子。

SD序列：在各種mRNA起始AUG上游約8～13核苷酸部位，存在一段由4～9個(gè)核苷酸組成的一致序列，富含嘌呤堿基，如-AGGAGG-，稱為Shine-Dalgarno序列(S-D序列)，又稱核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosomal binding site, RBS)。

密碼子的特點(diǎn)：1. 方向性(directional)2. 連續(xù)性(non-punctuated)3. 簡(jiǎn)并性(degeneracy)

4. 擺動(dòng)性(wobble)5. 通用性(universal)

起始密碼子(initiation codon)：AUG

終止密碼子(termination codon) ：UAA、UAG、UGA

tRNA的二級(jí)構(gòu)象特點(diǎn)：三葉草型四個(gè)環(huán)一個(gè)臂

tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)

——三葉草形、氨基酸臂、DHU環(huán)、反密碼環(huán)、額外環(huán)、TΨC環(huán)

三種RNA在蛋白質(zhì)生物合成中的作用：

mRNA的功能 :把DNA所攜帶的遺傳信息，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，抄錄并傳送至核糖體，用以決定其合成蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序。

rRNA的功能：參與組成核蛋白體，作為蛋白質(zhì)生物合成的場(chǎng)所。

tRNA的作用：運(yùn)載氨基酸：氨基酸各由其特異的tRNA攜帶，一種氨基酸可有幾種對(duì)應(yīng)的tRNA，氨基酸結(jié)合在tRNA 3ˊ-CCA的位置，結(jié)合需要ATP供能；

充當(dāng)“適配器”：每種tRNA的反密碼子決定了所攜帶的氨基酸能準(zhǔn)確地在mRNA上對(duì)號(hào)入座。

蛋白質(zhì)合成的部位、過程？

核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所。

蛋白質(zhì)合成過程：?翻譯的起始 核糖體與mRNA結(jié)合并與氨基酰-tRNA生成起始復(fù)合物；?肽鏈的延伸 核糖體沿mRNA5’端向3’端移動(dòng)，開始從N端向C端的多肽合成；?肽鏈的終止及釋放 核糖體從mRNA上解離準(zhǔn)備新一輪的合成反應(yīng)。

原核細(xì)胞和真核細(xì)胞在合成蛋白質(zhì)的起始有什么區(qū)別？（起始因子、起始氨酰-tRNA、核糖體不同等）

原核細(xì)胞

真核細(xì)胞

起始因子

IF-1,IF-2,IF-3

elF-3，eIF-2B、eIF-3、 eIF-6

elF-5,

起始tRNA

fMet-tRNAfMet

Met-tRNAMet

核糖體

30S小亞基首先與mRNA模板相結(jié)合，再與fMet-tRNAfMet結(jié)合，最后與50S大亞基結(jié)合。

40S小亞基首先與Met-tRNAMet相結(jié)合，再與模板mRNA結(jié)合，最后與60S大亞基結(jié)合生成80S·mRNA·Met-tRNAMet起始復(fù)合物

翻譯的特點(diǎn)：

真核生物

原核生物

遺傳密碼

相同

相同

轉(zhuǎn)錄與翻譯

不偶聯(lián)，mRNA的前體要加工

偶聯(lián)

起始因子

多、起始復(fù)雜

少

mRNA

5’端：帽子，3’端：尾巴，單順反子

5’端：Kozazk序列

無需加工，多順反子，5’端：SD序列

核糖體

大而復(fù)雜

簡(jiǎn)單

起始tRNA

tRNAimet

tRNAifmet

合成過程

需ATP，起始因子多，延長(zhǎng)因子少（EFT1、EFT2），一種釋放因子

需ATP、GTP，IF1、IF2、IF3

EF-TU、EF-TS、EFG、RF1、RF2、RF3

線粒體，葉綠體

獨(dú)立的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)

肽鏈延長(zhǎng)過程

1.進(jìn)位(positioning)/注冊(cè)(registration)：根據(jù)mRNA下一組遺傳密碼指導(dǎo)，使相應(yīng)氨基酰-tRNA進(jìn)入核蛋白體A位。 通過延伸因子EF-Ts再生GTP,形成EF-Tu?GTP復(fù)合物重新參與下一輪循環(huán)。需要消耗GTP，并需EF-Tu、EF-Ts兩種延伸因子

2. 成肽(peptide bond formation)：是由轉(zhuǎn)肽酶（transpeptidase）催化的肽鍵形成過程

3. 轉(zhuǎn)位(translocation)：核糖體向mRNA3’端方向移動(dòng)一個(gè)密碼子。需要消耗GTP，并需EF-G延伸因子

真核生物肽鏈合成的延長(zhǎng)過程與原核基本相似，但有不同的反應(yīng)體系和延長(zhǎng)因子。

另外，真核細(xì)胞核蛋白體沒有E位，轉(zhuǎn)位時(shí)卸載的tRNA直接從P位脫落。

蛋白質(zhì)合成后的加工修飾有哪些內(nèi)容

翻譯后加工

一級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾:

N-端Met(fMet)去除

二硫鍵的形成

個(gè)別氨基酸的修飾

羥化作用:羥脯氨酸

羥賴氨酸

酶活性中心的磷酸化

多蛋白的加工

一條合成后的多肽鏈經(jīng)加工產(chǎn)生多種不同活性的蛋白質(zhì)/多肽

高級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾:

亞基的聚合

HbA亞單位聚合

結(jié)合蛋白質(zhì)的合成

糖蛋白的合成

輔基連接

輔基(輔酶)與肽鏈的結(jié)合

蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的2種機(jī)制：翻譯中轉(zhuǎn)運(yùn) (cotranslational transport)：蛋白質(zhì)合成與跨膜運(yùn)送是同時(shí)進(jìn)行的。

翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)(posttranslational transport) ：蛋白質(zhì)在核糖體上合成后釋放到胞質(zhì)中。當(dāng)它們跨膜運(yùn)

送時(shí)，合成過程已完成，故稱為“轉(zhuǎn)譯后運(yùn)送”

第六章 分子生物學(xué)研究法

限制性核酸內(nèi)切酶：( RE)是一類核酸內(nèi)切酶，能識(shí)別雙鏈DNA分子內(nèi)部的特異序列, 并裂解磷酸二酯鍵。

載體：指基因工程中攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載工具，其本質(zhì)是DNA復(fù)制子。

核酸分子雜交：在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)

Southern雜交：即將DNA經(jīng)限制性酶切，凝膠電泳后，再轉(zhuǎn)移至膜上與標(biāo)記探針雜交的一種核酸分子雜交技術(shù)。特異性，敏感性，準(zhǔn)確性具佳。主要用于檢測(cè)基因組中特定的基因和序列，也常用于鑒定克隆DNA的特殊序列。

Northern雜交：:即將電泳分離后的變性RNA吸印到適當(dāng)?shù)哪ど显龠M(jìn)行分子雜交的技術(shù)。

重組DNA技術(shù)中常用的工具酶： 限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶Ⅰ、逆轉(zhuǎn)錄酶、T4DNA連接酶、堿性磷酸酶、末端轉(zhuǎn)移酶、Taq DNA聚合酶。

重組DNA技術(shù)中常用的載體： 載體按功能分為

克隆載體：為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。 質(zhì)粒、噬菌體、柯斯質(zhì)粒載體（又稱黏粒載體） 、酵母人工染色體、 細(xì)菌人工染色體、 動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）

表達(dá)載體：為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成 多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。根據(jù)宿主細(xì)胞分為：原核表達(dá)載體、真核表達(dá)載體。

PCR的反應(yīng)體系：模板DNA、特異性引物、耐熱DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+。

PCR的原理：針對(duì)目的DNA的5￠-和3￠-端，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，在每條引物的5￠-端分別加上不同的RE位點(diǎn)，然后以目的DNA為模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增便可得到帶有引物序列的目的DNA，再用相應(yīng)RE切割PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生黏端，隨后便可與帶有相同黏端的線性化載體進(jìn)行有效連接。

PCR的用途：（一）目的基因的克?。ǘ┗蛲蛔儯ㄈ〥NA和RNA的微量分析（四）DNA序列測(cè)定（五）基因突變分析

第七章 原核基因表達(dá)調(diào)控

操縱子：在原核生物中受同一蛋白質(zhì)調(diào)控的一個(gè)轉(zhuǎn)錄功能單位，由啟動(dòng)子（ promoter ）、操縱基因（operator）和結(jié)構(gòu)基因（structural gene)組成。

結(jié)構(gòu)基因：編碼蛋白質(zhì)或RNA的基因。

調(diào)節(jié)基因：產(chǎn)生調(diào)控蛋白，調(diào)控結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的基因。

弱化子：指原核生物操縱子中，能顯著減弱或終止轉(zhuǎn)錄作用的一段核苷酸序列。

轉(zhuǎn)錄因子：包括轉(zhuǎn)錄激活因子和轉(zhuǎn)錄阻遏因子。這類調(diào)節(jié)蛋白能識(shí)別并結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游序列或遠(yuǎn)端增強(qiáng)子元件，通過DNA—蛋白質(zhì)相互作用。

魔斑核苷酸：是細(xì)菌生長(zhǎng)過程中在缺乏氨基酸供應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的一個(gè)應(yīng)急產(chǎn)物。主要是三磷酸鳥苷（GTP）合成的四磷酸鳥苷（ppGpp）和五磷酸鳥苷（pppGpp）。主要功能是干擾RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合的專一性，誘發(fā)細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng)，幫助細(xì)菌在不良環(huán)境條件下得以存活。

簡(jiǎn)述乳糖操縱子在無乳糖、添加乳糖、葡萄糖和乳糖都存在時(shí)的工作原理。

1沒有乳糖，只有葡萄糖時(shí)，不產(chǎn)生利用乳糖的酶。

①有葡萄糖及cAMP濃度低時(shí)，CAP活性低，沒有正調(diào)控。

②沒有乳糖，沒有半乳糖時(shí)，阻遏蛋白可與操縱序列結(jié)合，起負(fù)調(diào)控作用。由于①、②轉(zhuǎn)錄受抑制，不產(chǎn)生利用乳糖的酶。

2.有葡萄糖，又有乳糖時(shí)，不利用乳糖。

①有葡萄糖及cAMP濃度低時(shí)，CAP活性低，沒有正調(diào)控。

②有乳糖，有半乳糖，阻遏蛋白不可與操縱序列結(jié)合，無負(fù)調(diào)控。 由于沒有正調(diào)控，轉(zhuǎn)錄處于低水平狀態(tài)，不產(chǎn)生利用乳糖的酶，細(xì)菌優(yōu)先利用葡萄糖。沒有葡萄糖，只有乳糖時(shí)，利用乳糖。

3.沒有葡萄糖，只有乳糖時(shí)，利用乳糖。

①?zèng)]有葡萄糖及cAMP濃度高時(shí)， CAP活性高，有正調(diào)控。

②有乳糖，有半乳糖，阻遏蛋白不可與操縱序列結(jié)合，無負(fù)調(diào)控。轉(zhuǎn)錄處于高水平，利用乳糖酶大量合成。

乳糖操縱子的組成和作用機(jī)制

1、乳糖操縱子的組成：大腸桿菌乳糖操縱子含Z、Y、A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因,分別編碼半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶,此外還有一個(gè)操縱序列O,一個(gè)啟動(dòng)子P和一個(gè)調(diào)節(jié)基因I.

2、作用機(jī)制：

1）阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)：沒有乳糖存在時(shí),I基因編碼的阻遏蛋白結(jié)合于操縱序列O處,乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài),不能合成分解乳糖的三種酶；有乳糖存在時(shí),乳糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)阻遏蛋白變構(gòu),不能結(jié)合于操縱序列,乳糖操縱子被誘導(dǎo)開放合成分解乳糖的三種酶.所以,乳糖操縱子的這種調(diào)控機(jī)制為可誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控.

2）CAP的正性調(diào)節(jié)：在啟動(dòng)子上游有CAP結(jié)合位點(diǎn),當(dāng)大腸桿菌從以葡萄糖為碳源的環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀樘菫樘荚吹沫h(huán)境時(shí),cAMP濃度升高,與CAP結(jié)合,使CAP發(fā)生變構(gòu),CAP結(jié)合于乳糖操縱子啟動(dòng)序列附近的CAP結(jié)合位點(diǎn),激活RNA聚合酶活性,促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合于操縱子后促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄,對(duì)乳糖操縱子實(shí)行正調(diào)控,加速合成分解乳糖的三種酶.

3）協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)：乳糖操縱子中的I基因編碼的阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控與CAP的正調(diào)控兩種機(jī)制,互相協(xié)調(diào)、互相制約.

色氨酸調(diào)控機(jī)制：

大腸桿菌色氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄受阻遏機(jī)制和弱化機(jī)制兩種機(jī)制的控制，前者通過阻遏蛋白和操縱基因的作用控制轉(zhuǎn)錄的起始，后者通過前導(dǎo)序列形成特殊的空間結(jié)構(gòu)控制轉(zhuǎn)錄起始后是否進(jìn)行下去。

）色氨酸操縱子的可阻遏系統(tǒng)： 在阻遏系統(tǒng)中，起負(fù)調(diào)控的調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是一個(gè)無活性的阻遏蛋白，色氨酸是輔阻遏物；當(dāng)色氨酸不足時(shí)，阻遏蛋白無活性，不能和操縱基因結(jié)合，色氨酸操縱子能夠轉(zhuǎn)錄；當(dāng)色氨酸充足時(shí)，阻遏蛋白和它結(jié)合而被激活，從而結(jié)合到操縱基因上，而色氨酸操縱子的操縱基因位于啟動(dòng)基因內(nèi)，因此，活性阻遏物的結(jié)合排斥了RNA聚合酶的結(jié)合，從而抑制了結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。

弱化子工作的原理及其生物學(xué)意義

原理：原核生物中，轉(zhuǎn)錄和翻譯偶連。前導(dǎo)區(qū)的轉(zhuǎn)錄緊接著前導(dǎo)mRNA的翻譯；

前導(dǎo)肽mRNA含2個(gè)連續(xù)的Trp密碼子，其翻譯對(duì)運(yùn)載色氨酸的tRNA濃度敏感。如果細(xì)胞中Trp濃度很低，核糖體就會(huì)在此暫停；核糖體的暫停改變前導(dǎo)mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，4區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時(shí)核糖體才進(jìn)行到1區(qū)，前導(dǎo)區(qū)結(jié)構(gòu)為2&3配對(duì)，不形成內(nèi)在性終止子（3-4配對(duì)）結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄繼續(xù)。如果細(xì)胞中Trp濃度高，核糖體很快通過2個(gè)連續(xù)的Trp密碼子，在4區(qū)被轉(zhuǎn)錄之前就到達(dá)2區(qū)，3&4配對(duì)，形成內(nèi)在性終止子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄終止。

生物學(xué)意義：氨基酸合成中的反饋抑制。經(jīng)濟(jì)的原則。

細(xì)菌利用阻遏和弱化雙重機(jī)制感受細(xì)胞內(nèi)外Trp的變化，精確調(diào)控Trp的合成。反應(yīng)靈敏。

單獨(dú)的弱化作用的效率很高，其他氨基酸操縱子如His、Leu，沒有阻遏蛋白，全靠弱化作用調(diào)節(jié)。效率高。

提供了一條不依靠調(diào)節(jié)蛋白，只依賴RNA結(jié)構(gòu)的基因表達(dá)調(diào)控途徑。

科學(xué)上，把培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)缺乏，蛋白質(zhì)合成停止后，RNA合成也趨于停止這種現(xiàn)象稱為嚴(yán)緊控制（rel+）；反之則稱為松散控制（rel-）。

魔斑的主要作用：

(1) ppGpp—四磷酸鳥苷(魔斑I magic spot I)

調(diào)控一些反應(yīng)的效應(yīng)物，主要功能是：

① 抑制rRNA基因的啟動(dòng)子與RNA聚合酶與結(jié)合的專一性；

② 抑制多數(shù)或大多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄的延伸。

(2) pppGpp—五磷酸鳥苷(魔斑II magic spot II)

當(dāng)細(xì)胞缺乏氨基酸時(shí)產(chǎn)生ppGpp，可在很大范圍內(nèi)做出應(yīng)急反應(yīng)，如抑制核糖體和其他大分子的合成，活化某些氨基酸操縱子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，抑制與氨基酸運(yùn)轉(zhuǎn)無關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，活化蛋白水解酶等。

與O序列結(jié)合: Lac阻遏蛋白

與P序列結(jié)合: RNA聚合酶

與CAP結(jié)合: 環(huán)一磷酸腺苷

與CAP位點(diǎn)結(jié)合:CAP-cAMP

第八章 真核基因表達(dá)調(diào)控

基因表達(dá)：基因轉(zhuǎn)錄成RNA再翻譯成蛋白質(zhì)的過程，稱基因表達(dá)。對(duì)rRNA、tRNA基因來說，其表達(dá)就是基因的轉(zhuǎn)錄。

管家基因：其表達(dá)產(chǎn)物為細(xì)胞生命活動(dòng)持續(xù)需要的、必不可少，如tRNA，rRNA基因，催化能量代謝的各種酶系，三羧酸循環(huán)中各種酶系等。

沉默子：某些基因含有負(fù)性調(diào)節(jié)元件——沉默子，當(dāng)其結(jié)合特異蛋白因子時(shí)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用。

順式作用元件：影響自身基因表達(dá)活性的非編碼DNA序列，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和沉默子。由于它們與特定的基因連鎖在一起，因此稱為順式作用元件。

反式作用因子：是指能直接或間接與順式作用元件結(jié)合、參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的蛋白質(zhì)。由于它們反式地激活或抑制另一基因的轉(zhuǎn)錄，故稱反式作用因子。

micro RNA:是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，它們?cè)趧?dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。大多數(shù)miRNA 基因以單拷貝、多拷貝或基因簇(cluster) 的形式存在于基因組中.

信號(hào)肽：在起始密碼子后，有一段編碼疏水性氨基酸序列的RNA區(qū)域，該氨基酸序列就被稱為信號(hào)肽序列，它負(fù)責(zé)把蛋白質(zhì)導(dǎo)引到細(xì)胞含不同膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞器內(nèi)。

RNA聚合酶Ⅱ基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄所需蛋白質(zhì)因子: P304

DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域：反式作用因子中的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域( DB) 每一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域有一個(gè)與DNA序列相互作用的基序（motif),多數(shù)基序含有一個(gè)插入DNA大溝的片段，能識(shí)別大溝的堿基序列。

常見有：螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋、鋅指結(jié)構(gòu)、亮氨酸拉鏈、螺旋-環(huán)-螺旋、同源異形結(jié)構(gòu)域 。

DNA甲基化的作用：DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。研究證實(shí)，CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化導(dǎo)致了人體1/3以上由于堿基轉(zhuǎn)換而引起的遺傳病。

DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)理:DNA甲基化導(dǎo)致某些區(qū)域DNA構(gòu)象變化，從而影響了蛋白質(zhì)與DNA的相互作用，抑制了轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)區(qū)DNA的結(jié)合效率。

原核生物與真核生物基因表達(dá)在哪個(gè)層次的調(diào)控最關(guān)鍵？

轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控

原核生物是通過操縱子進(jìn)行調(diào)控。真核生物每個(gè)基因都有其自身的基本啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)元件，單獨(dú)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，但在相關(guān)基因之間也存在著協(xié)同調(diào)節(jié)

基因表達(dá)調(diào)控的生物學(xué)意義是什么？

維持個(gè)體生長(zhǎng)、發(fā)育與分化； 適應(yīng)環(huán)境。