前言

由SARS-CoV-2感染引起的新冠肺炎仍在肆虐全球。截至2022年3月，全球近200個國家和地區(qū)已有4.6億確診病例，因新冠肺炎導致死亡人數(shù)達610萬人。除了以疫苗為主的預防病毒感染外，迫切需要在感染后盡早準確診斷新冠肺炎患者。發(fā)展一種高靈敏度和高準確度的可靠診斷方法，對判斷處于無癥狀潛伏期的密切接觸者是否發(fā)生SARS-CoV-2感染具有重要意義。由病毒編碼的miRNAs（vmiRNAs）已被報道在埃博拉感染患者的血清中發(fā)現(xiàn)，且比病毒基因組更早地被檢測到。同時也有文章報道了從SARS-CoV和SARS-CoV-2基因組中發(fā)現(xiàn)的vmiRNA。但到目前為止，在SARS-CoV-2感染患者中檢測vmiRNAs尚未見報道，對于SARS-CoV-2感染的早期檢測具有重要的意義。

近日，由同濟大學附屬東方醫(yī)院劉中民院長和俞作仁教授、上海市浦東新區(qū)疾病預防控制中心郝莉鵬副主任作為共同通訊作者，在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=18.187）雜志發(fā)表了題為“Identification of a SARS-CoV-2 virus-encoded small non-coding RNA in association with the neurological disorders in COVID-19 patients”的研究快訊，報道了從新冠患者中鑒定出了一種由SARS-CoV-2病毒編碼的microRNA（vmiRNA），且其可能與新冠肺炎患者的神經(jīng)系統(tǒng)障礙有關(guān)。

研究內(nèi)容解析

從新冠患者中鑒定出一個由 SARS-CoV-2基因組編碼的新的vmiRNA

研究者通過對SARS-CoV-2病毒基因組序列進行計算預測，并結(jié)合對新冠肺炎患者樣本的vmiRNA篩選分析，成功地鑒定出了一個由SARS-CoV-2編碼的vmiRNA及其前體（圖1a），研究者將前體命名為Pre-CvmiR-5，將成熟vmiRNA命名為CvmiR-5-5p。對9種冠狀病毒的BLAST分析表明，CvmiR-5-5p序列是SARS-CoV-2所特有的，并在SARS-CoV-2及其兩個主要突變株Delta株和Omicron株中保守。

為了驗證病毒感染后CvmiR-5-5p在人細胞中的生物發(fā)生，研究者合成了CvmiR-5前體，通過載體轉(zhuǎn)染人肺泡基底上皮細胞系A(chǔ)549，通過RT-qPCR檢測及對擴增產(chǎn)物的一代測序，驗證了成熟的CvmiR-5-5p在宿主細胞中的生物發(fā)生，其長度在20-23nt之間（圖1b和c）。此外，研究者通過對SARS-CoV-2病毒感染的Calu-3細胞小RNA測序公共數(shù)據(jù)進行分析，同樣證明了病毒感染后，宿主細胞中可以檢測到CvmiR-5-5p（圖1d）。

圖1 | 從新冠患者中鑒定出一個由 SARS-CoV-2基因組編碼的新的vmiRNA

CvmiR-5-5p用于 SARS-CoV-2感染診斷的潛力

接下來，作者定量比較了患者血清、痰和鼻拭子樣本中CvmiR-5-5p的檢測靈敏度。對8例不同類型新冠肺炎患者和8例正常對照的血清進行RT-qPCR檢測，CvmiR-5-5p在所有患者血清中均可檢測到（Ct值范圍為約32-35），而在正常對照的血清中均未檢測到（圖2e）。具有不同癥狀的患者之間的CvmiR-5-5p水平的比較表明，CvmiR-5-5p的豐度與疾病的進展和嚴重程度呈正相關(guān)（圖2f）。

為了比較CvmiR-5-5p在不同類型樣本中的豐度，研究者又對5例新冠肺炎患者的血清和鼻拭子樣本，進行了RT-qPCR定量。CvmiR-5-5p在血清和鼻拭子樣本中都得到了很好的擴增。在五名患者中，有三名患者的血清CvmiR-5-5p水平明顯高于鼻拭子，且這三例患者均為無癥狀感染者。除此之外還有一名患者的血清CvmiR-5-5p水平低于鼻拭子，而他也是唯一一例有癥狀的患者。

此外，研究者還偶然收集了一名新冠肺炎患者的血清和痰樣本。定量分析顯示痰中CvmiR-5-5p的水平顯著高于血清中的水平（圖2h），提示痰標本可能是一種富含CvmiR-5-5p的標本，便于快速檢測。

這些結(jié)果表明，基于CvmiR-5-5p的SARS-CoV-2檢測方法具有較高的特異性，并提示了血清CvmiR-5-5p在患者產(chǎn)生癥狀前的早期診斷中的潛力，以及痰樣本的可用性。當然，這些結(jié)論還需要用更大規(guī)模的樣本進一步證實。

圖 2 |? CvmiR-5-5p用于 SARS-CoV-2感染診斷的潛力

CvmiR-5-5p可能在新冠肺炎患者神經(jīng)功能障礙的發(fā)生中起著重要的調(diào)控作用

最后，為了探討CvmiR-5-5p在新冠肺炎發(fā)病機制中的作用，研究者通過Miranda軟件預測了CvmiR-5-5p的靶基因并進行了GO和KEGG功能富集分析（圖1i）。結(jié)果顯示，在人類宿主細胞中，共有8610個mRNAs被預測為CvmiR-5-5p的潛在靶點，并且令人驚訝的是，人類神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)通路，包括神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)元分化的調(diào)節(jié)，是GO分析中最富集的五個通路（圖3J）。此外，研究者還對過表達CvmiR-5前體的A549細胞進行了轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）分析，將差異表達基因與CvmiR-5-5p的靶基因取交，通過通路分析進一步證明CvmiR-5參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、神經(jīng)/感覺系統(tǒng)、病毒感染性疾病和代謝過程。這些提示CvmiR-5-5p在新冠肺炎的發(fā)病過程，特別是在新冠肺炎患者神經(jīng)功能障礙的發(fā)生中起著重要的調(diào)控作用。

圖 3 | CvmiR-5-5p可能在新冠肺炎患者神經(jīng)功能障礙的發(fā)生中起著重要的調(diào)控作用

研究結(jié)論

（1）鑒定并證明了新冠患者體內(nèi)存在由SARS-CoV-2基因組編碼的vmiRNA，CvmiR-5-5p。

（2）基于CvmiR-5-5p的SARS-CoV-2檢測方法具有較高的特異性，并提示了血清CvmiR-5-5p在無癥狀感染者的早期診斷中的潛力。

（3）CvmiR-5-5p可能在新冠肺炎患者神經(jīng)功能障礙的發(fā)生中起著重要的調(diào)控作用

同濟大學附屬東方醫(yī)院的趙倩、汪瓊、王義興以及上海市浦東新區(qū)疾病預防控制中心的趙冰為共同第一作者。文章中轉(zhuǎn)錄組測序及分析服務(wù)由歐易生物完成。

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