??大家在構建表達載體時，有時候需要單個啟動子啟動多個ORF的表達，此時就要用到多順反子載體，其中常用的元件有IRES（Internal Ribosome Entry Site，內(nèi)部核糖體進入位點）和2A肽（2A peptide），例如，目的基因需要和選擇標記基因共表達，即轉(zhuǎn)錄出來的mRNA上有兩個基因，如果它們直接連在一起，會導致第二個基因無法起始翻譯或翻譯出來后蛋白結構相互影響而無法發(fā)揮正常功能等，在兩者之間插入IRES或2A肽可以解決這一問題。那么這IRES和2A肽各自有什么特點，通常該怎么選呢？今天小編帶大家一起來看看吧~?

IRES

?????? ?IRES最早發(fā)現(xiàn)于病毒基因組，如昆蟲病毒和哺乳動物病毒。后來在一些真核生物基因組中也發(fā)現(xiàn)了類似的序列。IRES是一段具有特殊結構的RNA序列，能夠折疊成類似起始tRNA的結構，直接結合核糖體而不依賴5’端帽子結構，獨立翻譯除翻譯起始位點以外的mRNA序列，從而實現(xiàn)多個基因在同一mRNA上獨立翻譯。

圖1 目的序列通過IRES連接與抗性基因PuroR共表達的載體圖譜

2A肽

????? ?2A肽最早發(fā)現(xiàn)于足口病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）的2A基因。2A肽是一段短肽序列，通常由18-22個氨基酸組成。在翻譯過程中，2A肽的C端與N端之間不會形成肽鍵，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的自我剪切。即通過將2A肽序列插入到兩個基因之間，可以使得翻譯過程中蛋白質(zhì)自動剪切，從而實現(xiàn)多個蛋白質(zhì)的獨立表達。目前常用的2A肽有四種：P2A、T2A、E2A和F2A。P2A最早發(fā)現(xiàn)的2A肽之一，由18個氨基酸組成，剪切效率最高；T2A由20個氨基酸組成，剪切效率較P2A次之；E2A由18個氨基酸組成，剪切效率較低；F2A由22個氨基酸組成，剪切效率也較低。

圖2 目的序列通過T2A連接與綠色熒光蛋白ZsGreen共表達的載體圖譜

IRES和2A肽的區(qū)別：

IRES的優(yōu)缺點：

?????? 優(yōu)點：IRES 被放置于兩個ORF 之間的時候，可以同時表達這兩個ORF。由于兩個ORF 分別有自己的起始密碼子和終止密碼子，所以會翻譯兩個獨立的、沒有經(jīng)過修飾的蛋白。IRES 鏈接的每個多順反子翻譯出來的多肽段是分開的，這就避免了融合蛋白和插入蛋白水解位點策略所帶來的蛋白失活，錯誤標記等問題，還不會帶來多啟動子載體中啟動子相互干擾或抑制的問題。

?????? 缺點：IRES 的存在有時候會影響mRNA的結構，同時由于IRES和mRNA的5’帽子 對核糖體/或翻譯起始復合物的結合力不同，IRES 后面的ORF 翻譯蛋白的水平有可能與IRES 前面的ORF 蛋白水平不一致。有的時候前面的ORF 表達很好，但后面的ORF 表達水平不高；有的時候后面的ORF和/或IRES會影響前面ORF的表達，甚至前面的ORF根本不表達。

2A肽的優(yōu)缺點：

?????? 優(yōu)點：兩個基因（ORF）通過2A肽鏈連接成為一個ORF，mRNA翻譯成一個融合蛋白，但這兩個融合蛋白會被識別2A的蛋白酶切成兩個蛋白。這兩個蛋白的摩爾比理論上是1:1。

??缺點：蛋白酶切割會發(fā)生在2A肽C端的甘氨酸（G）和脯氨酸（P）之間。所以，前一個蛋白的尾巴上會留下一個20 多個氨基酸的多肽。后面一個蛋白的N 端會留下一個多余的脯氨酸。尤其是第一個蛋白，如果是一個小分子（比如分泌型的細胞因子），可能其功能會受到這20多個多肽的影響。