前言

衰老會導(dǎo)致免疫功能進(jìn)行性失調(diào)，幾乎影響免疫系統(tǒng)的所有組成部分，也將增加對多種疾病的易感性。然而，老年免疫系統(tǒng)成分組織特異性變化以及它們的保守性仍然知之甚少。

2021年01月，美國華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究團(tuán)隊在Immunity期刊（IF：43.474）發(fā)表了題為的研究成果，采用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序 (scRNA-seq) ， 單細(xì)胞免疫組庫測序 (TCR, BCR)，質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù) (CyTOF)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)， 表位轉(zhuǎn)錄組測序 CITE-seq測序等研究方法，全面描述了免疫衰老的細(xì)胞景觀，并發(fā)現(xiàn)了一個新的衰老細(xì)胞標(biāo)志——表達(dá)CD8 的克隆顆粒酶K (GZMK) 并在物種之間保守的T細(xì)胞。GZMK ?CD8 ?T 細(xì)胞的一個獨特亞群在在衰老環(huán)境中驅(qū)動產(chǎn)生，并且可以通過增加 GZMK 的分泌而促成免疫衰老表型。這一系列工作提示GZMK ?細(xì)胞有望成為解決年齡相關(guān)免疫系統(tǒng)功能障礙的潛在靶細(xì)胞。

研究背景

為了揭示免疫系統(tǒng)中與年齡相關(guān)的復(fù)雜變化，文章結(jié)合使用單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 和單細(xì)胞免疫組庫測序（TCR/BCR）對免疫細(xì)胞進(jìn)行測序，然后應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行廣泛的功能驗證。利用流式細(xì)胞術(shù)、質(zhì)譜流式(CyTOF) 單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對人類血細(xì)胞亞群進(jìn)行詳細(xì)分析，將在小鼠中的發(fā)現(xiàn)在人樣本中得到驗證。作者全面描述了免疫衰老的細(xì)胞景觀，并發(fā)現(xiàn)了一個新的衰老細(xì)胞標(biāo)志——表達(dá) CD8 和GZMK 的T 細(xì)胞群。并通過機(jī)制驗證，表明GZMK CD8 ?T 細(xì)胞在衰老進(jìn)程中發(fā)育產(chǎn)生，具備通過增加 GZMK分泌而促成炎癥表型的功能。文章研究成果將為緩解免疫衰老，改善免疫功能提供有力的幫助。

研究思路

研究結(jié)果

1、免疫系統(tǒng)衰老的共同變化以及器官特異性變化

文章首先分析了年輕（3-6 個月）和老年（17-24 個月）C57BL/6J 小鼠的免疫系統(tǒng)概況。從年輕和老年小鼠的四個器官：免疫器官（脾臟）、外周免疫區(qū)室（腹膜腔）、呼吸器官（肺）和代謝活躍器官（肝臟）分選CD45免疫細(xì)胞，并進(jìn)行了 scRNA-、TCR- 和 BCR-seq 測序（圖1A）。數(shù)據(jù)聚類揭示了各個器官中的主要免疫細(xì)胞群在衰老過程中發(fā)生的一些變化（圖 1 B-1D )。最引人注目的觀察是 GZMK ?CD8 ?T 細(xì)胞在所有四個器官中的積累。器官特異性變化包括與年齡相關(guān)的自然殺傷 (NK) 細(xì)胞和幼稚 T (Tn) 細(xì)胞減少；脾臟和腹膜 B 細(xì)胞的改變；腹膜、肺和肝中巨噬細(xì)胞亞群的變化；脾調(diào)節(jié)性 T (Treg) 細(xì)胞增加（圖 1B -1D）。

圖1 | 老年小鼠免疫系統(tǒng)單細(xì)胞圖譜

a)概述免疫系統(tǒng)的單細(xì)胞分析；

b)帶注釋的細(xì)胞簇；

c)細(xì)胞分布 ；

d)與年齡相關(guān)的簇比例的倍數(shù)變；

2、先天免疫系統(tǒng)衰老的器官特異性變化

作者對年輕和老年小鼠進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)分析，以驗證骨髓和先天淋巴細(xì)胞的年齡相關(guān)變化（圖2A 和 2B）。這些改變包括腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量的顯著減少（圖 2 C）和肺泡巨噬細(xì)胞的減少（圖 2 D)。這一過程被老年小鼠肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞 (IMΦ) 和肝巨噬細(xì)胞中單核細(xì)胞 (CCR2 和 CX3RC1) 的增加所抵消（圖 2 D-2F）。與 scRNA-seq 數(shù)據(jù)一致，衰老小鼠的多個器官中 NK 細(xì)胞的比例降低（圖 2 G）。

衰老改變增加了脾臟和腹膜Zbtb32 B 細(xì)胞亞群（圖 2 H-2J）。隨著年齡的增長，腹膜 B-1 細(xì)胞（第 3 組）和脾臟Zbtb32 B 細(xì)胞（第 7 組）的兩個 B 細(xì)胞亞群顯示出在老年小鼠中的克隆性增加（圖 2 K）。為了評估這種表型是否與克隆反應(yīng)相關(guān)，作者分析了 CD4T 細(xì)胞中配對的 TCRα/TCRβ 庫。作者發(fā)現(xiàn)，與研究組織內(nèi)的年輕小鼠相比，老年小鼠的 CD4 TCR 多樣性沒有改變（圖 2 P)。此外，作者發(fā)現(xiàn)年輕和老年小鼠的組織之間幾乎沒有共享 CD4 TCR 克?。▓D 2 P 和 2Q）。這些結(jié)果表明，衰老過程中各種器官中促炎 CD4 ?T 細(xì)胞的積累與其 TCR 多樣性的深刻改變無關(guān)。

圖2 | 小鼠免疫細(xì)胞群的年齡相關(guān)變化

a)腹腔MΦ 種群的比例（流式細(xì)胞術(shù)）

b)肺MΦ 種群的比例（流式細(xì)胞術(shù)）

c)肝臟MΦ 種群的比例（流式細(xì)胞術(shù)）

d)肝臟MΦ 種群的比例（流式細(xì)胞術(shù)）

e)脾臟中 ABC 的比例（流式細(xì)胞術(shù)）

除此之外，作者還研究了代謝分類器中的所有奇數(shù)鏈脂肪酸（OCFAs），并對它們進(jìn)行了斯皮爾曼等級相關(guān)系數(shù)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LysoPC（17：0/0：0）與SM（d18：1/15：0或d16：1/17：0）和LysoPC（15：0/0：0）呈正相關(guān)，而PC（15：0/24：0）與其他OCFA呈負(fù)相關(guān)。

3、GZMK ?CD8 ?T 細(xì)胞在多個器官中表現(xiàn)為衰竭標(biāo)志物和年齡相關(guān)性標(biāo)志物

接下來，作者關(guān)注與年齡相關(guān)的 CD8 ?T 細(xì)胞室重塑。CD8 ?Tn 細(xì)胞的比例下降，而 PD-1 ?CD8 ?T 細(xì)胞的比例增加 。然而，與 CD4 T 細(xì)胞相比，PD-1 CD8 ?T細(xì)胞標(biāo)志著獨特細(xì)胞亞群的出現(xiàn)（圖 3A -3C）。這些與年齡相關(guān)的 (Taa) CD8細(xì)胞的特征在是Gzmk的表達(dá)，這也是最特異性的標(biāo)志物之一。

CD8 ?Taa 細(xì)胞不同于傳統(tǒng)的 Tem 細(xì)胞，其特征在于共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子 TOX 和檢查點分子，包括 PD-1（圖 3 C）。單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq ）數(shù)據(jù)證明了 Taa 細(xì)胞特異性Gzmk和Pdcd1轉(zhuǎn)錄物共表達(dá)，證實 PD-1和 TOX可用于識別健康小鼠中的這種細(xì)胞群。因此，使用 TOX 和 PD-1 作為 CD8 Taa 細(xì)胞的標(biāo)志物，并在流式細(xì)胞術(shù)中證實，這些細(xì)胞的比例在所有研究器官的老年小鼠中增加（圖 3D-3E）。

接下來，作者評估了 CD8 T 細(xì)胞亞群中的 TCR 庫。與 CD4 ?T 細(xì)胞數(shù)據(jù)相反，作者觀察到老年 CD8 ?T 細(xì)胞的克隆性增加，這些細(xì)胞集中在 CD8 Taa 細(xì)胞簇內(nèi)，但不在 Tem 亞群內(nèi)（圖 3 F-3H）。值得注意的是，在老年小鼠的不同器官中同時發(fā)現(xiàn)了相同的 TCR 克隆，但在年輕小鼠中卻沒有（圖3G）?？傊?，這些結(jié)果表明，CD8 ?Taa 細(xì)胞經(jīng)歷了克隆擴(kuò)增，并在老年小鼠的各種器官中積累了常見的 TCR 克隆。

克隆擴(kuò)增的細(xì)胞群的存在通常與 T 細(xì)胞活化的歷史有關(guān)。事實上，CD8 Taa 細(xì)胞中 IFNγ 和 CCL5 的表達(dá)水平與CD8 Tem 細(xì)胞相似（圖 3 I）。然而，當(dāng)體外刺激老年小鼠的總 CD8 T 細(xì)胞時，它們分泌的 GZMK 量顯著增加。這種表型是由于CD8 Taa 細(xì)胞分泌顯著更多的 GZMK（圖 3 J 和 3K）。這些數(shù)據(jù)表明，CD8 Taa 細(xì)胞具有特定的促炎特征，其特征在于 GZMK 的產(chǎn)生增加。

圖3 | 衰老對小鼠 CD8 T 細(xì)胞群的影響

4、CD49d 是與組織定位相關(guān)的 CD8Taa 細(xì)胞的標(biāo)志物

作者接下來預(yù)測了細(xì)胞-細(xì)胞配體-受體相互作用 （圖 4A和 4B）。CD8 Taa 細(xì)胞CD49d 的膜蛋白表達(dá)水平在組織和血液中均增加了（圖 4 C-4E)。在循環(huán)中，CD49d 表達(dá)對 CD8 Taa 細(xì)胞群具有高度特異性，所以作者將 CD49d 的組成型表達(dá)確定為這些細(xì)胞的關(guān)鍵標(biāo)志物之一。為了進(jìn)一步分析和驗證，作者專注于 FN1 作為一種原型分子，它可以與免疫細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞外基質(zhì)成分和 CD49d 結(jié)合。在老年小鼠的各種器官中，作者證實 PD-1 CD8 T 細(xì)胞可以在富集 FN1 的區(qū)域中，它們與 FN1 發(fā)生物理相互作用（圖 4 F-4G)。這些結(jié)果表明 FN1-CD49d 軸可能控制組織歸巢和 CD8 Taa 細(xì)胞的相互作用。

在成纖維細(xì)胞中，F(xiàn)n1 的表達(dá)伴隨著衰老相關(guān)分泌表型 (SASP) 成分（例如Il6、Ccl2和Cxcl1）在各種器官中的高基礎(chǔ)基因表達(dá)水平（圖4H）。首先，作者發(fā)現(xiàn)，在小鼠 3T3 成纖維細(xì)胞中，外源添加的 GZMK 顯著增強(qiáng)了 IFNγ 誘導(dǎo)的 IL-6 和 CCL5 分泌，炎癥因子隨著衰老而增加(圖 4 I)。作者利用多柔比星模型在 3T3 成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)體外衰老和 SASP。這表明即使在沒有經(jīng)典炎性細(xì)胞因子的情況下，GZMK 的分泌也有可能加劇 SASP，并表明從 CD8 Taa 細(xì)胞釋放的 GZMK可能是衰老過程中炎癥過程的重要調(diào)節(jié)因子（圖4K）。

圖4 | CD49d 在 CD8 Taa 細(xì)胞與組織中其他細(xì)胞類型之間的串?dāng)_中發(fā)揮作用

5、CD8 Taa 細(xì)胞的發(fā)育是由老化環(huán)境驅(qū)動的

接下來，作者研究了老年小鼠中 CD8 Taa 細(xì)胞的積累是否取決于細(xì)胞內(nèi)在機(jī)制。為此，作者將同源標(biāo)記的脾 CD8 T 細(xì)胞從年輕小鼠轉(zhuǎn)移到年輕或老年小鼠中（圖 5A）。在老年小鼠中，移植后 1 個月足以將循環(huán)供體 CD8 T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 TOX + PD-1 +表型，其程度與宿主 CD8 T 細(xì)胞相同（圖 5 A-5C），CD49d 的表達(dá)促進(jìn)它們在各個器官中的積累（圖 5 D-5F)。重要的是，CD8T 細(xì)胞轉(zhuǎn)移到年輕宿主中并沒有導(dǎo)致這種表型（圖 5 A-5F）。

最后，為了研究 CD8 Taa 細(xì)胞的生存是否依賴于老年環(huán)境，作者將 CD8 T 細(xì)胞（包括 TOX ?PD-1細(xì)胞群）從老年小鼠轉(zhuǎn)移到年輕小鼠身上（圖 5 G）。CD8 Taa 細(xì)胞在年輕的環(huán)境中保持了 TOXPD-1表型并保持了升高 CD49d 水平（圖 5 G-5K）。結(jié)果表明，CD8Taa 細(xì)胞的發(fā)育和擴(kuò)增取決于細(xì)胞外在的年齡相關(guān)因素，并且分化的 CD8Taa 細(xì)胞具有穩(wěn)定的表型，這與歸巢到組織的高能力有關(guān)。

圖5 | CD8Taa 細(xì)胞的發(fā)育是由老化環(huán)境的組成部分驅(qū)動的

6、scATAC-Seq 將 EOMES 鑒定為 GZMK ?CD8 ?T 細(xì)胞的潛在調(diào)節(jié)劑

為了研究老年免疫細(xì)胞群中潛在的基因調(diào)控程序，作者對來自年輕和老年小鼠的 17,081 個 CD45脾細(xì)胞進(jìn)行了 scATAC-seq 分析，并確定了 15 個不同的簇（圖 6 A）。scATAC-seq 峰值注釋表明，這些簇合理匹配 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中識別的主要免疫細(xì)胞群的轉(zhuǎn)錄特征（圖 6 A、6B）。

作者從頭基序發(fā)現(xiàn)確定了每個簇特異的共有轉(zhuǎn)錄因子 (TF) 結(jié)合基序（圖 5 E）。結(jié)果表明 EOMES 和 T-BET 在 CD8 Taa 細(xì)胞發(fā)育中的不同作用。同樣，作者跟進(jìn)了作為 CD4T 細(xì)胞的年齡相關(guān)特征出現(xiàn)的 AP-1 基序富集（圖 6 E），并證實了年齡相關(guān) Treg 細(xì)胞中 BATF 在 RNA 和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)升高（圖 5 C 和 5G）。

這些結(jié)果突出了 CD8Taa 和 Tex 細(xì)胞之間的相似性，顯示了這些細(xì)胞群之間的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳平行性，但也表明 CD8Taa 細(xì)胞在老年小鼠中存在明顯的表觀遺傳調(diào)控。

圖6 | 通路富集分析顯示了腫瘤和基質(zhì)的不同代謝特征

7、GZMK CD8 ?T 細(xì)胞是人類炎癥的標(biāo)志

鑒于 GZMK 作為衰老小鼠 CD8 T 細(xì)胞的關(guān)鍵標(biāo)志物的出現(xiàn)，作者首先分析了來自非肥胖健康年輕人和老年人的 CD8T 細(xì)胞循環(huán)群（圖 7A）。對常規(guī) CD8 T 細(xì)胞的分析顯示，CD8 Tn 細(xì)胞比例顯著降低，Tcm 和 Tem 細(xì)胞群增加，但老年人的 Temra 細(xì)胞群沒有顯著變化（圖 7 E 和 7F）。鑒于作者觀察到 GZMK 和 GZMB 主要定位于不同的細(xì)胞，這表明 Tem 細(xì)胞室可能含有不同的亞群。

使用流式細(xì)胞術(shù)，作者驗證了 CD57 和 CD28可以定義了 CD8 Tem 細(xì)胞內(nèi)的兩個不同子集（圖 7 G）。數(shù)據(jù)證明了與年齡相關(guān)的具有高 GZMK 表達(dá)水平的 T 細(xì)胞亞群在老年人的 CD8 T 細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增，而在健康個體中，兩個表達(dá) GZMB 的亞群并沒有明顯改變。

在 CyTOF 和流式細(xì)胞儀分析下，作者利用 CITE-seq 數(shù)據(jù)確定 Tem-k 亞群中表達(dá)高水平的 CD45RO 和低水平的 CD57的部分（圖 7 L）。表明 Tem-k 簇主要對應(yīng)于 CD57 - Tem 細(xì)胞。對 CD8細(xì)胞群的進(jìn)一步研究使作者找到與其分化程序相關(guān)的 TF（圖 7 O）。結(jié)果表明，GZMK CD8 Tem-k 和 Tcm 細(xì)胞具有不同的表觀遺傳景觀，并且與小鼠中的 Taa 細(xì)胞相似，可能依賴于 T-BET 和 EOMES 保持轉(zhuǎn)錄調(diào)控之間的平衡。

圖7 | 通路富集分析顯示了腫瘤和基質(zhì)的不同代謝特征

相關(guān)討論

作者對免疫細(xì)胞群中與年齡相關(guān)的變化進(jìn)行了廣泛的描述。作者的數(shù)據(jù)揭示了衰老的免疫系統(tǒng)中器官特異性變化，并強(qiáng)調(diào)克隆性 GZMK CD8 Taa 細(xì)胞的出現(xiàn)是免疫衰老最顯著的細(xì)胞標(biāo)志之一。在高齡小鼠中，循環(huán)中的所有 CD8 T 細(xì)胞中近一半獲得 GZMK Taa 表型。這種細(xì)胞群對衰老生理學(xué)意義重大。

作者表明，CD8 Taa 細(xì)胞的發(fā)育依賴于衰老環(huán)境。一旦分化成 Taa 表型，這些細(xì)胞就會上調(diào) CD49d 表達(dá)并獲得有效組織歸巢的能力。作者將克隆 GZMK CD8Taa 細(xì)胞鑒定為健康老年動物中真正不同的亞群，并強(qiáng)調(diào)它們通過 GZMK 分泌對免疫衰老的潛在貢獻(xiàn)。

scATAC-seq 分析表明 T-BOX 調(diào)節(jié)程序可能支持 CD8T 細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)?GZMK +表型。作者發(fā)現(xiàn)克隆 GZMK CD8 ?Tem-k 細(xì)胞亞群隨著人類年齡的增長而增加。這些細(xì)胞具有獨特的表觀遺傳景觀，表明 T-BOX 轉(zhuǎn)錄因子參與了它們的發(fā)育。然而，人類 CD8T 細(xì)胞也包括一個獨特的 GZMB Tem-b 細(xì)胞亞群，它在小鼠中沒有直接的等價物。這種差異可能與小鼠在無病原體條件下衰老有關(guān)，而人類的免疫系統(tǒng)受到多種病原體暴露的影響。

總之，作者的結(jié)果將 GZMK CD8 T 細(xì)胞確定為免疫衰老的標(biāo)志，并強(qiáng)調(diào)這些細(xì)胞以及 GZMK 本身是解決與年齡相關(guān)的免疫系統(tǒng)功能障礙的潛在靶標(biāo)。?

小鹿推薦

該團(tuán)隊為了揭示免疫系統(tǒng)中與年齡相關(guān)的復(fù)雜變化，綜合利用了單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 和單細(xì)胞免疫組庫 (TCR, BCR)測序。在機(jī)制探索上，用流式細(xì)胞術(shù)、質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù) (CyTOF) 以及CITE-seq)技術(shù)對人類血細(xì)胞亞群進(jìn)行同步驗證分析，以便將實驗發(fā)現(xiàn)進(jìn)行多物種驗證。

實驗技術(shù)上，除了進(jìn)行廣泛的功能驗證和多種成像方法。作者還建立了一個專用網(wǎng)絡(luò)資源，用于開放探索年輕和年老小鼠和人類的免疫細(xì)胞群。

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