細(xì)胞凋亡(Apoptosis)?是生物界廣泛存在的一種現(xiàn)象,與其它的生命現(xiàn)象一樣具有同等重要的生理學(xué)或病理學(xué)意義。盡管其最終結(jié)果也是導(dǎo)致細(xì)胞死亡,但其誘導(dǎo)因素、發(fā)生機(jī)制和過(guò)程及意義均明顯不同于一般的病理性細(xì)胞死亡(即細(xì)胞壞死性死亡,簡(jiǎn)稱細(xì)胞死亡)?。??細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征與細(xì)胞壞死性死亡的形態(tài)特征不同。細(xì)胞壞死性死亡是被動(dòng)的病理性死亡,其形態(tài)特征首先是膜通透性增加,細(xì)胞外型發(fā)生不規(guī)則變化,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,核染色質(zhì)不規(guī)則移位,進(jìn)而線粒體及核腫張,溶酶體破壞,細(xì)胞膜破裂,胞漿外溢,這種死亡?過(guò)程常常引起炎癥反應(yīng)。細(xì)胞凋亡則是在某些因素的誘導(dǎo)下,由細(xì)胞內(nèi)在的有規(guī)律的機(jī)制引起的,是主動(dòng)的生理性細(xì)胞自殺。其特征是細(xì)胞首先變圓,隨即與鄰近細(xì)胞脫離,失去微絨毛,胞漿濃縮,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張呈泡狀并與細(xì)胞膜融合,線粒體無(wú)明顯變化,核染色質(zhì)濃縮成塊并凝聚在核膜周邊,胞膜內(nèi)陷將細(xì)胞自行分割為多個(gè)有外膜包裹、內(nèi)涵物不外溢的凋亡小體,后被吞噬細(xì)胞或鄰周細(xì)胞所識(shí)別、吞噬。由于細(xì)胞凋亡過(guò)程不導(dǎo)致溶酶體破壞及胞膜破裂,沒(méi)有細(xì)胞內(nèi)容物外泄,故不引起炎癥反應(yīng),在生理?xiàng)l件下,生物體內(nèi)細(xì)胞存活與死亡是由自身發(fā)育階段提供的遺傳信息,或由鄰近細(xì)胞和其微環(huán)境提供的信號(hào)決定的,其中包括細(xì)胞相互接觸提供的信號(hào)以及周圍環(huán)境中活性物質(zhì)、激素等。

細(xì)胞壞死是極端的物理、化學(xué)因素或嚴(yán)重的病理性刺激引起的細(xì)胞損傷和死亡,是非正常死亡。長(zhǎng)期以來(lái)細(xì)胞壞死被認(rèn)為是因病理而產(chǎn)生的被動(dòng)死亡,但是近期的研究表明,細(xì)胞壞死可能是細(xì)胞“程序性死亡”的另一種形式,具有包括引發(fā)炎癥反應(yīng)在內(nèi)的重要生理功能。當(dāng)細(xì)胞凋亡不能正常發(fā)生而細(xì)胞必須死亡時(shí),壞死作為凋亡的“替補(bǔ)”方式被采用。

細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法有很多,下面介紹常用的形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法。

1.光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

凋亡細(xì)胞的主要特征為核染色質(zhì)致密深染,形成致密質(zhì)塊,有時(shí)可碎裂。在HE染色的組織切片中細(xì)胞體積縮小,胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強(qiáng),并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細(xì)胞常以分散單個(gè)形式存在,凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞分離,不引起炎癥反應(yīng)。

本方法簡(jiǎn)便易行,但在細(xì)胞密集的組織中對(duì)于改變不典型的細(xì)胞判斷較困難,常缺乏較為特征的指標(biāo),具有較強(qiáng)的主觀性,重復(fù)性差。本方法可用于調(diào)亡現(xiàn)象的初步觀察,作為分析指標(biāo)之一。

1)未染色細(xì)胞:

凋亡細(xì)胞的體積變小、變形,全面皺縮,細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,細(xì)胞凋亡晚期可見(jiàn)凋亡小體,凋亡小體為數(shù)個(gè)圓形小體圍繞在細(xì)胞周圍。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。

2)染色細(xì)胞:

姬姆薩(Giemsa)染色、瑞氏染色等:正常細(xì)胞核色澤均一;凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、邊緣化,核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài);壞死細(xì)胞染色淺或沒(méi)染上顏色。

蘇木素-伊紅(HE)染色:細(xì)胞核固縮碎裂、呈藍(lán)黑色、胞漿呈淡紅色(凋亡細(xì)胞),正常細(xì)胞核呈均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色,壞死細(xì)胞核呈很淡的藍(lán)色或藍(lán)色消失。

2.熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來(lái)評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。

常用的DNA特異性染料有:Hoechst 33342,Hoechst 33258,DAPI。三種染料與DNA 的結(jié)合是非嵌入式的,主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料,能進(jìn)入正常細(xì)胞膜而對(duì)細(xì)胞沒(méi)有太大細(xì)胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高。DAPI為半通透性,用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。

PI和Hoechst33342雙標(biāo):

PI、Hoechst33342均可與細(xì)胞核DNA(或RNA)結(jié)合。但DAPI不能通過(guò)正常細(xì)胞膜,Hoechst則為膜通透性熒光染料,故細(xì)胞在處于壞死或晚期調(diào)亡時(shí)細(xì)胞膜被破壞,這時(shí)可為PI著紅色。

正常細(xì)胞和中早期調(diào)亡細(xì)胞均可被Hoechst著色,但是正常細(xì)胞核的Hoechst著色的形態(tài)呈圓形,淡蘭色,內(nèi)有較深的蘭色顆粒;而調(diào)亡細(xì)胞的核由于濃集而呈亮蘭色,或核呈分葉,碎片狀,邊集。故PI著色為壞死細(xì)胞;亮蘭色,或核呈分葉狀,邊集的Hoechst著色的為調(diào)亡細(xì)胞。

凋亡細(xì)胞體積變小,細(xì)胞質(zhì)濃縮。細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期:

Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased),部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài);

Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;

Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊,產(chǎn)生凋亡小體。

3.電子顯微鏡

雖然光學(xué)顯微鏡下可以看見(jiàn)胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體,但凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化大多發(fā)生在超微結(jié)構(gòu),因此用光鏡觀察難以令人滿意,而透射電鏡可清楚地觀察到細(xì)胞結(jié)構(gòu)在凋亡不同時(shí)期的變化。電鏡形態(tài)學(xué)觀察是迄今為止判斷凋亡最經(jīng)典、最可靠的方法,被認(rèn)為是確定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。

檢測(cè)方法:

透射電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定,丙酮脫水,環(huán)氧樹(shù)脂包埋,超薄切片,醋酸枸椽酸電子又重染色,透射電鏡觀察。掃描電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定,乙醇逐級(jí)脫水,CO2臨界點(diǎn)干燥,真空噴金,掃描電鏡觀察。

結(jié)果評(píng)判:

可見(jiàn)凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失,核染色質(zhì)固縮、邊集,常呈新月形,核膜皺褶,胞質(zhì)緊實(shí),細(xì)胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。

缺點(diǎn):

1)只能定性,不能定量;

2)標(biāo)本處理過(guò)程復(fù)雜,設(shè)備相對(duì)昂貴,對(duì)檢查者的技術(shù)水平要求較高,不適于大批標(biāo)本檢測(cè);

3)在組織切片上進(jìn)行電鏡觀察時(shí),有時(shí)凋亡很難與正常細(xì)胞有絲分裂相鑒別,因?yàn)閮煞N情況下都可出現(xiàn)染色質(zhì)濃聚。如同時(shí)進(jìn)行熒光染色,可彌補(bǔ)電鏡檢查的不足。

4.流式細(xì)胞技術(shù)

流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞是通過(guò)檢查其光射特征及熒光參數(shù)時(shí)行的。細(xì)胞穿過(guò)流式細(xì)胞儀的激光束集點(diǎn)時(shí)使激光發(fā)生散射,分析散射光可以提供細(xì)胞大小及結(jié)構(gòu)的信息。由于光散射牧場(chǎng)生并非凋亡細(xì)胞的特異性指標(biāo),細(xì)胞的機(jī)械性損傷和細(xì)胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此,只有將光散射特性的檢測(cè)與熒光參數(shù)的檢測(cè)結(jié)合起來(lái)才能準(zhǔn)確地辨認(rèn)凋亡細(xì)胞。

細(xì)胞凋亡過(guò)程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解,導(dǎo)致小分子DNA漏出,核DNA含量下降,細(xì)胞熒光染色后作流式細(xì)胞儀分析,可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細(xì)胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰(xub-G1峰,即AP峰--apoptotic peak),代表凋亡細(xì)胞。

細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果直觀,至今仍是判定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的金標(biāo)準(zhǔn),但觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征耗時(shí)費(fèi)力,不適于大量凋亡樣本的檢測(cè)。

Hoechst 染料

最初由 Hoechst AG公司發(fā)明。這是一家德國(guó)公司,創(chuàng)建于1863年,后來(lái)經(jīng)過(guò)數(shù)次合并,變成了Sanofi-Aventis(賽諾菲)集團(tuán)的子公司。它們所有的試劑都以數(shù)字編號(hào)命名,也就是說(shuō)Hoechst 33342是該公司合成的的第33342種化合物。類似的染料一共有三種:Hoechst 33258、Hoechst 33342和 Hoechst 34580。33342和33258最常用,激發(fā)/發(fā)射光譜也比較接近。

三種染料都可在LUYOR-3410高強(qiáng)度紫外線燈發(fā)出的350nm左右的紫外光激發(fā)。都在461nm處發(fā)出藍(lán)靛色熒光。未被結(jié)合的染料更大發(fā)射光在510到540nm之間?？杀浑?氬燈或水銀-氬燈或紫外線燈等激發(fā)光源激發(fā)。激發(fā)光和發(fā)射光之間的斯托克斯位移巨大,故可用于多染料多顏色熒光染色。Hoechst染料的熒光強(qiáng)度隨著溶液pH升高而增強(qiáng)。

Hoechst染料溶于水和有機(jī)溶劑,如二甲基甲酰胺或二甲基亞砜。濃度可高達(dá)10mg/mL.水溶液可在4℃避光保存至少6個(gè)月。長(zhǎng)期儲(chǔ)存于≤-20℃。Hoechst與DNA雙鏈中的小溝(minor groove)結(jié)合,更傾向于富含A/T(腺嘌呤/胸腺嘧啶)的DNA鏈。雖然說(shuō)它能與所有的核酸結(jié)合,但是富含A/T的雙鏈DNA使熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。Hoechst可穿過(guò)細(xì)胞膜,可結(jié)合于活細(xì)胞或固定過(guò)的細(xì)胞。因此可用于活細(xì)胞標(biāo)記,Hoechst能與DNA結(jié)合,干擾DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂,因此有致畸和致癌危險(xiǎn)。使用和廢棄需謹(jǐn)慎。

Hoechst 33342,也稱bisBenzimide H 33342或HOE 33342。分子式為C27H28N6O?3HCl?3H2O,分子量為615.99,CAS Number 23491-52-3。 Hoechst 33342是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料,對(duì)細(xì)胞的毒性較低。Hoechst 33342染色常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè),染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。Hoechst 33342也常用于普通的細(xì)胞核染色,或常規(guī)的DNA染色。Hoechst 33342的更大激發(fā)波長(zhǎng)為346nm,更大發(fā)射波長(zhǎng)為460nm;Hoechst 33342和雙鏈DNA結(jié)合后,更大激發(fā)波長(zhǎng)為350nm,更大發(fā)射波長(zhǎng)為461nm。Hoechst 33342溶于水,溶解度可達(dá)20mg/ml。用于細(xì)胞核染色時(shí),推薦的Hoechst 33342工作濃度為0.5-10μg/ml。Hoechst 33342對(duì)人體有害,請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)。熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題,建議染色后盡量當(dāng)天完成檢測(cè)。 為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

DAPI染料:

DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole),是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料,常用于熒光顯微鏡觀測(cè)。因?yàn)镈API可以透過(guò)完整的細(xì)胞膜,它可以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。

當(dāng)DAPI與雙股DNA結(jié)合時(shí),在熒光顯微鏡的紫外光源照射觀察下,DAPI染劑在358nm(紫外線)處有一個(gè)更大吸收峰,并在461nm(藍(lán))處有一個(gè)更大發(fā)射峰,其發(fā)射光的波長(zhǎng)范圍含蓋了藍(lán)色至青綠色,因此在熒光顯微技術(shù)中DAPI被紫外線照亮且被藍(lán)或青色濾鏡檢出。DAPI也可以和RNA結(jié)合,但產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度不及與DNA結(jié)合的結(jié)果,其發(fā)射光的波長(zhǎng)范圍約在400nm左右。

DAPI可用于固定細(xì)胞染色,但是因?yàn)榛罴?xì)胞染色對(duì)DAPI濃度有嚴(yán)格要求,它很少被用于活細(xì)胞染色。DAPI能快速進(jìn)入活細(xì)胞中與DNA結(jié)合,因此DAPI對(duì)生物體而言,也被視為一種毒性物質(zhì)與致癌物。然而在MSDS中它被標(biāo)記為無(wú)毒。盡管DAPI沒(méi)有顯現(xiàn)出對(duì)E.coli的誘變性,它在機(jī)器制造商提供的信息上被認(rèn)為是一種DNA誘變劑。由于DAPI可以摻入DNA螺旋中,它很有可能有底層的DNA誘變性,因此應(yīng)小心配置和使用DAPI。