自1985年噬菌體展示技術出現(xiàn)以來，在絲狀噬菌體表面展示的抗體庫已被用于識別多種不同目的的特異性結(jié)合物，包括識別腫瘤。噬菌體展示技術是一種高通量技術，可篩選數(shù)十億隨機融合抗體，這些抗體幾乎可以針對癌細胞表面或細胞內(nèi)的任何靶點，甚至是患者血清中發(fā)現(xiàn)的可溶性標志物。許多噬菌體展示衍生的針對重要腫瘤標志物的結(jié)合物已被鑒定。越來越多的抗體被廣泛應用于腫瘤研究及臨床的各個環(huán)節(jié)。

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用于分子診斷和疾病的單克隆抗體

廣泛應用于抗原檢測和人類疾病的抗體因其高度特異性和低毒性使成為了極具前景的醫(yī)藥商品。實際上，它們是僅次于疫苗的第二大臨床開發(fā)生物藥品類別。自1997年FDA批準首個抗體藥——抗cd20嵌合抗體利妥昔單抗以來，利妥昔單抗已成為許多非霍奇金淋巴瘤治療策略的組成部分。

單克隆抗體通常通過用抗原免疫實驗動物(如小鼠)獲得，篩選得到一株產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤。雜交瘤技術是最常用的單克隆抗體制備技術之一，但由于實驗動物免疫系統(tǒng)存在偏差，這限制了獲得針對保守哺乳動物蛋白的高親和力抗體的能力。尤其是在應用于針對人類的治療性抗體的領域，這些蛋白質(zhì)的異源性通常使它們對人類具有免疫原性，從而引發(fā)HAMA反應(人類抗小鼠抗體)。

抗體人源化繞開了這一瓶頸，通過用人框架同源序列替換小鼠序列來最大限度地減少HAMA應答。人源化抗體已成為當今許多疾病治療的現(xiàn)實，包括癌癥的治療和診斷。然而，一些應用可能會受到其分子大小的限制。它們對組織(如實體瘤)的穿透性較差，并且通過空間約束與某些分子表面的功能重要區(qū)域結(jié)合較差或不結(jié)合?？贵w片段，如Fab(片段抗原結(jié)合)，scFv(單鏈可變片段)是減少抗體大小和增加其滲透到組織的替代方案，納米抗體的出現(xiàn)完美解決了這一難題。

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構(gòu)建和篩選絲狀噬菌體表面人源抗體組合文庫是獲得人源抗體及其片段的適宜方法。這些文庫可以是合成的，也可以從人類患者的庫中獲得，結(jié)合物的選擇是針對之前定義的配體，從而產(chǎn)生完全人源性抗體片段，理論上的免疫原性低于鼠源或人源化抗體片段?？贵w噬菌體展示技術為研究、診斷和治療提供了大量的人源重組抗體。2003年，F(xiàn)DA批準了第一種噬菌體展示抗體阿達木單抗(Adalimumab)用于類風濕性關節(jié)炎。目前，它還廣泛用于銀屑病、關節(jié)炎、強直性脊柱炎和克羅恩病。接下來我們將主要梳理來自幼稚細胞或免疫文庫的Fab、scFv、sdAb或其他抗體片段的例子。

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抗體噬菌體展示庫

噬菌體展示技術由George P.Smith于1985年提出，描述外源肽在噬菌體顆粒表面的呈現(xiàn)。這是基于觀察到，來自Inoviridae家族的噬菌體(M3,fd,fl)經(jīng)過適當包裝，即使在外源肽與其衣殼蛋白融合的情況下仍保持感染性。通過基因操作獲得噬菌體展示文庫。數(shù)以億計的肽、蛋白變體、抗體片段編碼基因被克隆到一個融合到絲狀噬菌體外殼蛋白(pIII或pVIII)基因5'的載體中。這些噬菌體庫被用來轉(zhuǎn)化細菌，這些細菌也會被輔助噬菌體感染。輔助噬菌體感染使病毒顆粒在其表面顯示融合蛋白。由于外殼蛋白僅為展示肽提供錨定，因此不應干擾其結(jié)構(gòu)，并允許肽及其相應基因的親和純化。這一原理也適用于抗體片段在絲狀噬菌體表面的呈遞。

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可以采用不同的策略獲得抗體組合噬菌體展示文庫。根據(jù)人類可變輕庫(VL)和可變重庫(VH)構(gòu)建了一些合成或半合成文庫。最常用的是Griffin-1文庫，它由體內(nèi)使用的大部分人類VH和VL基因片段組成，使用合成的寡核苷酸產(chǎn)生更多的CDR3多樣性(半合成)，以及Tomlinson I文庫，它由單一的人類框架組成，多樣性包含在VH和VL結(jié)構(gòu)域的18個氨基酸位置，主要位于抗原結(jié)合位點(合成)。在這兩個庫中，抗體均顯示為scFvs。從這些文庫中獲得了幾種人抗體，單獨或聯(lián)合用于生物淘洗工藝。另一種策略是通過擴增一個或多個個體的可變基因庫來構(gòu)建文庫。為此，我們使用了覆蓋所有V基因家族的引物，文庫由VL和VH鏈編碼基因隨機組合而成。同樣，抗體編碼基因被組裝成Fab或scFv抗體片段。從理論上講，每個克隆都編碼一個特定的抗原結(jié)合位點，該位點來自于通過人工結(jié)構(gòu)域外推原始結(jié)構(gòu)域而增加的自然結(jié)構(gòu)域。

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噬菌體展示技術總體方案

(A)?通過mRNA提取、cDNA克隆到噬菌體載體和噬菌體增殖的方法建立噬菌體展示文庫;

(B)?生物篩選:在幾輪篩選過程中，對腫瘤細胞的親和性驅(qū)動靶特異性結(jié)合物的富集。

淘選過程在體外模擬了B細胞克隆篩選系統(tǒng)，方法是特異性富集具有所需特異性抗體的噬菌體顆粒。在建庫過程中，確保庫的多樣化是很重要的，因此庫的大小對于嘗試為任何特定抗原選擇結(jié)合形式的有效性是至關重要的。組合抗體庫可以從免疫或未免疫的供體中構(gòu)建。可選擇提供針對不同類型抗原的高親和力抗體:半抗原、蛋白質(zhì)、多肽和碳水化合物

篩選方法大多基于4個主要步驟:制備噬菌體展示文庫，吸附特異性結(jié)合噬菌體，去除非特異性或低親和力噬菌體，回收目標結(jié)合物，細菌感染后再擴增，進行下一輪篩選。篩選過程導致噬菌體與所選的純或不純抗原特異性結(jié)合的順序富集。這些篩選步驟將重復3-5次，直到鑒定出高特異性/親和力的結(jié)合物。

普健生物噬菌體展示抗體發(fā)現(xiàn)平臺具有強大的篩選能力，滿足高通量抗體開發(fā)需求，擁有包括隨機肽庫、免疫庫和天然庫在內(nèi)的千億級庫容，可以構(gòu)建多物種（人源、小鼠、兔子、羊駝等）抗體文庫以及多種類型（scfv、Fab、VHH 等）的抗體文庫。

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選擇細胞表面的噬菌體是發(fā)展腫瘤靶向治療的重要一步。它為獲得針對未知和非免疫原性細胞表面抗原的抗體提供了機會。隨著靶抗原越來越復雜，如細胞表面，選擇過程變得更加困難。細胞膜上有大量的蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類作為潛在抗原。它們的表達水平可因細胞而異，這使得相關抗原在所有細胞膜成分中存在的量很小。因此，每一輪的選擇都需要相對大量的細胞，這使得該技術對于通常從器官和組織中獲得的小細胞群的應用變得困難。但噬菌體展示文庫在這里就體現(xiàn)出了強大的應用前景。

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普健生物噬菌體文庫的類型

隨機肽庫：將化學合成的隨機寡核苷酸序列與噬菌體的表面蛋白基因融合，在噬菌體表面表達出各種氨基酸組合的 隨機序列短肽。利用噬菌體展示隨機肽庫可以高通量篩選各種抗原的抗原表位

免疫庫：免疫庫由經(jīng)過免疫 ( 包括疫苗注射、微生物感染、自身免疫疾病、腫瘤等 ) 后的供體 B 淋巴細胞的抗體 基因構(gòu)建。對于特定免疫抗原的抗體淘選的效率較高，但一般僅適用于一種特異性抗體的選擇，庫容量要求不高，一般106-108的庫容量就可滿足需要

天然庫：采用不經(jīng)免疫的人或動物來源的外周血淋巴細胞、骨髓、脾細胞的 B 細胞作為材料，進行基因擴增，但親 和力通常較低。骨髓內(nèi)和骨髓外所有抗體基因都包含在內(nèi)，所構(gòu)建的抗體庫適用于所有抗原所對應的抗體的選擇，庫容 量要求較高，最小需要達到 109 ，因為目前估算的自然界的抗原種類在這個數(shù)量級上

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普健生物噬菌體展示技術平臺優(yōu)勢

1. 豐富的噬菌體抗體技術經(jīng)驗，五年以上噬菌體抗體開發(fā)，交付上百個噬菌體展示抗體開發(fā)項目

2. 具有全人源重組抗體庫，庫容高達千億級別（1011 pfu)，兩步建庫法，保證了文庫的多樣性，抗體庫片段插入

正確率高；可以兩周拿到全人源重組抗體

3. 可以構(gòu)建多物種（人源、小鼠、兔子、羊駝等）抗體文庫

4. 可以構(gòu)建多種類型（scfv、Fab、VHH 等）的抗體文庫

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噬菌體展示技術為快速發(fā)現(xiàn)腫瘤抗原抗體提供了有力的手段。它容易實現(xiàn)，操作方便，成功率高。與小鼠雜交瘤技術產(chǎn)生的抗體相比，噬菌體展示技術抗體的優(yōu)點是直接分離出全人源抗體，而小鼠雜交瘤技術需要費力地將候選引物人源化。目前，許多噬菌體展示抗體已進入生物制藥市場。單克隆抗體通過調(diào)節(jié)固有的腫瘤細胞通路和激活針對腫瘤細胞的固有免疫反應，已成為標準的抗癌藥物。顯然，噬菌體展示技術衍生的人類抗體可以與早期產(chǎn)品競爭，只要它們針對的是明確定義的靶點，如EGFR或VEGF通路。噬菌體展示技術在藥物研發(fā)中發(fā)揮著重要作用，許多噬菌體分子已獲得FDA批準，許多噬菌體分子已進入臨床試驗。我們可以期待，在不久的將來會有更大的改進，噬菌體展示將為腫瘤學帶來更多的貢獻。

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