2023年2月20日，南京大學閆超、陳迪俊及劉翔宇團隊合作在Nature Neuroscience（IF=28.776）上發(fā)表了題為《Lipid-accumulated reactive astrocytes promote disease progression in epilepsy》的研究論文，該研究發(fā)現(xiàn)在顳葉癲癇（TLE）患者和癲癇小鼠模型中，星形膠質細胞中過度的脂質積累導致反應性星形膠質細胞（LARAs）的形成，這是一種新的反應性星形膠質細胞亞型，其特征是APOE表達升高。文中使用了漢恒生物的在體研究工具產(chǎn)品：AAV2/9-gfaABC1D-A2AR-shRNA-eGFP，用于星形膠質細胞中A2AR的特異性敲低。?

癲癇是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，約30%的患者最終發(fā)展為耐藥癲癇，并伴有不可預測的復發(fā)性癲癇發(fā)作，除了手術外，治療選擇有限。致癲癇灶內的神經(jīng)元死亡和神經(jīng)膠質瘢痕的形成是耐藥性癲癇的兩個主要病理組織學特征。反應性星形膠質細胞是神經(jīng)膠質瘢痕的主要細胞成分，與阿爾茨海默?。ˋD）、帕金森病（PD）和多發(fā)性硬化癥（MS）等幾種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的神經(jīng)元活動和神經(jīng)元死亡有關。然而，與癲癇相關的反應性星形膠質細胞的分子特征及其對疾病病理的貢獻尚不清楚。

在這項研究中，研究者在癲癇患者的大腦中發(fā)現(xiàn)了一種新的反應性星形膠質細胞狀態(tài)，它們積累脂滴（LD）。這些LARAs以APOE依賴的方式形成，表現(xiàn)出獨特的轉錄特征，并加劇了神經(jīng)元的過度興奮性。干預神經(jīng)元-星形膠質細胞的脂質轉移或脂質代謝可減少LARA的形成并減輕癲癇發(fā)作癥狀。這些發(fā)現(xiàn)表明，LARAs代表了癲癇患者大腦中一種功能失調和潛在靶向的反應性星形膠質細胞狀態(tài)。

下面，我們一起來了解具體的研究內容：

1. 顳葉癲癇患者腦內脂質積累異常

研究者首先通過分析耐藥TLE患者的磁共振波譜（MRS）數(shù)據(jù)，研究是否可以觀察到癲癇患者的大腦中異常的脂質積累，這是最常見的局灶性癲癇形式。與同一參與者的對側正常側相比，TLE患者的致癇灶的脂質信號明顯增加，表明癲癇腦內脂質異常積累。然后檢測LD累積情況，發(fā)現(xiàn)在TLE參與者的神經(jīng)元（NeuN+）和星形膠質細胞（GFAP+）中，LD形成顯著增加。TLE參與者的脂質水平顯著高于正常對照組。這些數(shù)據(jù)表明，致癇灶異常脂質積累是耐藥TLE患者的一個重要病理特征。

圖1 癲癇患者脂質積累異常

2. 癲癇模型脂質積累

上述臨床觀察結果在經(jīng)典紅藻酸（KA）誘導的小鼠癲癇模型中得到證實。KA誘導的局灶性癲癇模型建立成功后，研究者使用MRS來定量小鼠大腦中的脂質水平。在注射后24h（急性）和3周（慢性），癲癇小鼠海馬的脂質信號顯著升高。為了更好地模擬TLE參與者的全身性慢性癲癇發(fā)作，研究者用腹腔注射（i.p.）KA刺激小鼠。C57BL/6小鼠i.p.注射后約20 min發(fā)生急性癲癇發(fā)作，注射KA后2至3周內慢性反復發(fā)作。在慢性階段，小鼠海馬PLIN2/BD493染色和電鏡均顯示LD在神經(jīng)元和星形膠質細胞中積累。人類和小鼠的數(shù)據(jù)都表明，大腦中過度的脂質積累是癲癇的一個重要病理特征。

圖2 癲癇小鼠模型脂質積累異常

3. 顳葉癲癇患者的單核RNA測序

為了檢測異常的脂質積累是否會導致癲癇患者大腦的脂質代謝改變，研究者使用新鮮收集的TLE參與者和年齡匹配的非TLE對照組的皮質樣本進行了單核RNA測序（snRNA -seq）。星形膠質細胞通過典型標志物GFAP、FGFR3、GJA1、AQP4和ALDH1L1的表達來定義。對snRNA-seq數(shù)據(jù)的基因富集分析顯示，星形膠質細胞中脂質轉運相關和代謝相關通路明顯激活，而在神經(jīng)元中僅中度激活。然后，研究者在星形膠質細胞簇中的TLE參與者和對照組之間進行了差異表達分析，并確定了一組與脂質感知、運輸、存儲和水解相關的上調基因。其中，脂質轉運基因APOE（編碼載脂蛋白E）是星形膠質細胞中TLE參與者和對照組之間表達差異最大的基因之一。與對照組相比，星形膠質細胞中APOE蛋白表達更高。免疫印跡法也證實了TLE參與者樣本中APOE表達的升高。與患者的結果相似，KA誘導的癲癇小鼠海馬星形膠質細胞中APOE的表達也顯著上調。

綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明癲癇患者的大腦中與疾病相關的星形細胞脂質代謝功能障礙，并確定APOE是參與這一過程的關鍵基因。

圖3 癲癇患者和癲癇小鼠模型的星形膠質細胞脂質代謝異常和APOE上調

4. APOE介導脂質從神經(jīng)元轉移到星形膠質細胞

在大腦中，APOE蛋白主要由星形膠質細胞產(chǎn)生，是脂質運輸?shù)闹饕d體。為了揭示APOE在癲癇中的作用，研究者首先用KA（i.p.）誘導癲癇。并評價APOE敲除（KO）對KA刺激21 d后小鼠海馬脂質積累的影響。與野生型癲癇小鼠相比，APOE敲除對KA刺激小鼠海馬神經(jīng)元LD形成的影響較??；然而，APOE?/?癲癇小鼠海馬星形膠質細胞中的脂質積累被阻斷，表明APOE是星形膠質細胞中脂質積累所必需的，而在神經(jīng)元中不是。因此，研究者假設，在慢性癲癇條件下，脂質最初在神經(jīng)元中積累，然后通過APOE依賴的機制不斷轉移到星形膠質細胞中。為了進一步證明這一點，研究者比較了野生型癲癇小鼠（靜脈注射后21d）中APOE不同表達水平的星形膠質細胞中的脂質積累情況；APOE陽性（APOE+）星形膠質細胞比APOE陰性（APOE?）星形膠質細胞顯示出更高的脂質積累水平。

然后，研究者通過將ALDH1L1- CreERT2小鼠與APOE-floxP小鼠雜交，生成了APOE的星形細胞特異性條件敲除（cKO）。與APOE?/?小鼠類似，星形細胞在KA刺激下，特異性APOE細胞cKO小鼠在星形膠質細胞中LD積累顯著減少，但在神經(jīng)元中沒有。總之，這些數(shù)據(jù)表明，星形膠質細胞APOE介導了癲癇條件下脂質從神經(jīng)元到星形膠質細胞的主動運輸。

圖4 星形膠質細胞的脂質積累需要APOE介導

圖5 生成APOE的星形細胞特異性條件敲除（cKO）小鼠

5. 顳葉癲癇患者反應性星形膠質細胞的分子圖譜分析

研究者接下來探討星形膠質細胞中異常的脂質積累是否與癲癇中的星形膠質細胞反應性有關。為了準確定義TLE參與者的反應性星形膠質細胞亞型，研究者使用snRNA-seq數(shù)據(jù)對星形膠質細胞簇進行了亞群分析。進一步將星形膠質細胞群體劃分為6個亞聚類（A1-A6）。GO通路分析顯示，脂質轉運相關通路主要富集在A4亞簇中，APOE表達水平很高。APOEhi A4亞簇顯示出一個獨特的上調基因亞集，其中許多與脂質轉移和代謝有關，如CLU、PTGDS和PLCG2，這是一個轉錄組特征，與以前報道的反應性星形膠質細胞亞型不同的轉錄組特征。因此，研究者將A4亞群指定為LARAs。

圖6 反應性星形膠質細胞的分子圖譜分析

6. APOE是小鼠模型中脂質積累的反應性星形膠質細胞形成所必需的

為了檢測LARA的形成是否需要APOE，研究者在野生型和APOE?/?小鼠的海馬中進行了轉錄組分析，分別檢測了對照組和KA組75個LARA相關基因的表達。基因聚類分析顯示，大多數(shù)被檢測的基因都有明顯的逆轉模式。統(tǒng)計分析顯示，75個基因中有65個（86.7%）在KA刺激下發(fā)生了顯著變化，并被APOE-KO恢復。這些數(shù)據(jù)表明，APOE介導的星形膠質細胞中的脂質積累導致了小鼠癲癇模型中LARA的形成。

圖7 APOE介導脂質積聚反應性星形膠質細胞的形成

7. 脂質積累的反應性星形膠質細胞與癲癇小鼠的癲癇發(fā)作活動有關

在功能上，反應性星形膠質細胞已被證明可促進AD和MS患者的神經(jīng)炎癥或神經(jīng)元丟失。研究者假設，TLE相關的LARAs可以促進神經(jīng)元放電，并加劇癲癇的持續(xù)病程。為了證明這一點，研究者首先比較了野生型和APOE cKO小鼠之間的KA誘導的癲癇癥狀。與KA刺激的野生型小鼠相比，APOE cKO小鼠的Racine評分較低，發(fā)作頻率降低，發(fā)作持續(xù)時間較短。由于LARA的形成依賴于APOE，這些結果表明LARAs具有促癲癇作用，并證明了APOE介導的脂質轉運在癲癇中的病理影響。與此相一致的是，用CDP-膽堿治療癲癇小鼠，有效地降低了KA刺激的野生型小鼠的癲癇發(fā)作活動。然而，在APOE?/?小鼠中，CDP-膽堿對KA誘導的癲癇發(fā)作的保護作用完全被消除。因此，通過脂質轉運或代謝干預靶向LARA可以有效緩解癲癇癥狀，預防疾病進展。

圖8 脂質積聚的反應性星形膠質細胞與癲癇小鼠的發(fā)作活動有關

8. 脂質積累的反應性星形膠質細胞通過星形膠質細胞A2AR促進癲癇發(fā)作活動

為了探索LARA介導的神經(jīng)元毒性的分子機制，研究者在體外使用游離FAs治療野生型或APOE?/?小鼠的原代星形膠質細胞，模擬LARA的形成。采用RNA-seq分析，探索FAs處理和APOE KO誘導的差異表達基因。這些顯著改變的星形膠質細胞基因中有77.5%（404/521）在FAs處理的野生型和APOE?/?星形膠質細胞之間表現(xiàn)出相反的模式。這些基因中有許多在神經(jīng)元傳遞相關的通路中富集。值得注意的是，腺苷2A受體（A2AR）存在于兩種途徑中，并在FAs處理下上調，但被APOE KO阻斷。這與A2AR KO小鼠對乙醇誘導的癲癇有抵抗力的觀察結果相一致。在星形膠質細胞（GFAP+）和神經(jīng)元（MAP2+）表面均觀察到A2AR的表達。此外，與野生型對照組相比，KA刺激的APOE?/?小鼠的星形膠質細胞A2AR顯著降低。這些結果表明，LARAs表達高水平的A2AR，至少部分原因是APOE介導的脂質積累。

為了檢測LARA的促癲癇作用是否需要A2AR，研究者使用AAV2/9-gfaABC1D-A2AR-shRNA-eGFP結構選擇性地敲低小鼠海馬星形膠質細胞中A2AR的表達。這種敲低只針對星形膠質細胞，而不影響神經(jīng)元中A2AR的表達。在KA刺激小鼠的腦切片中使用全細胞膜片鉗記錄，研究者發(fā)現(xiàn)與A2AR敲低的星形膠質細胞（eGFP+）相鄰的海馬錐體神經(jīng)元表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)元興奮性和神經(jīng)傳遞降低。此外，通過對來自TLE參與者的新鮮皮層樣本的體外MEA記錄，研究者發(fā)現(xiàn)A2AR拮抗劑ZM241385治療顯著降低了人腦切片中癲癇樣放電的頻率和持續(xù)時間。這些結果表明，A2AR表達的升高在LARA介導的神經(jīng)毒性中起著核心作用。星形膠質細胞中A2AR的過表達已被證明降低了星形膠質細胞對興奮性氨基酸轉運體（EAATs）的表達和對谷氨酸的攝取，導致神經(jīng)元興奮異常?？傊@些數(shù)據(jù)表明，LARA可以通過效應蛋白A2AR促進神經(jīng)元放電。

圖9 脂質積累的反應性星形膠質細胞通過星形膠質細胞A2AR促進癲癇發(fā)作活動

研究者的工作確定了一種以前未知的反應性星形膠質細胞亞型。在本研究中，研究者報道了一種新的亞型-LARA的存在，其特征是LD過度積累和脂質代謝異常。研究者的研究結果表明，在耐藥TLE參與者和癲癇小鼠中，星形膠質細胞中異常的脂質積累導致LARAs的形成，促進神經(jīng)元反復放電，最終導致神經(jīng)元丟失；而APOE KO阻止星形膠質細胞中的脂質積累，抑制LARA的形成，減輕癲癇發(fā)作和疾病進展。因此，靶向LARAs可能為耐藥癲癇提供替代治療選擇。