|? ?編者按? ?|

作為強大的結構解析工具，冷凍電鏡在解析蛋白質結構中具有超強能力。RNA作為另外一種生物大分子，在生命活動中發(fā)揮著與蛋白質同等關鍵的作用，解析它們的三維結構也是科學家們持久探索的問題。但RNA由于分子量小，柔性大等因素，無論是依靠冷凍電鏡還是其他結構解析手段，這一目的在往日很難實現(xiàn)。近日，哈佛大學廖茂富博士和尹鵬博士合作，利用ROCK技術改造RNA，賦能冷凍電鏡技術，解析了多種RNA的高分辨結構，進一步擴展了冷凍電鏡技術的應用場景，也為揭示RNA參與的生命活動，以及圍繞RNA的藥物開發(fā)，打開了全新局面。

作為遺傳分子DNA的姊妹，RNA支持著我們生活的世界。進化生物學家曾提出假設，認為在DNA和它所編碼的蛋白質出現(xiàn)之前，RNA就已經(jīng)存在并具有自我復制功能。而現(xiàn)代科學發(fā)現(xiàn)，只有不到3%的人類基因組被轉錄成信使RNA(mRNA)分子，并在后續(xù)被翻譯成蛋白質。相比之下，82%的基因組被轉錄成具有其他未知功能的RNA分子。

為了了解單個RNA分子的功能，在原子和分子鍵的層面上對其三維結構進行解析是極其必要的。通過對DNA和蛋白質分子進行結晶處理，研究人員已經(jīng)可以通過X射線晶體學方法或核磁共振方法進行常規(guī)的結構研究。然而，由于RNA的分子構成和結構柔性特點，它們往往難以結晶，因此這些需要結晶的方法并不適用于解析RNA分子的結構。?

近日，哈佛大學韋斯生物啟發(fā)工程研究所(Wyss)的尹鵬博士和哈佛大學醫(yī)學院(HMS)的廖茂富博士合作完成了一項研究，報告了一種對RNA分子進行結構研究的新技術"ROCK"。該技術可以將多個相同的RNA分子組裝成一個高度組織化的結構，大大降低單個RNA分子的靈活性，并使其分子量成倍增加。應用于具有不同大小和功能的知名模型RNA作為基準，該團隊表明ROCK技術能夠將冷凍電鏡 (cryo-EM) 方法應用在包含RNA亞基的生物大分子的結構解析上。他們的研究結果發(fā)表在《自然-方法》上。

與廖茂富博士一起領導這項研究的尹鵬博士說:「ROCK技術正在打破目前針對RNA進行結構研究的限制，使RNA分子的近原子級分辨率結構得以揭示，這一過程往往難以甚至無法用傳統(tǒng)的方法實現(xiàn)。我們期望這一進展能為基礎研究和藥物開發(fā)的許多領域注入活力，包括正在蓬勃發(fā)展的RNA療法?！?/p>

獲得對RNA的控制權

尹鵬博士的研究團隊開發(fā)了多種方法，包括DNA磚塊和DNA折紙術，這些方法使DNA和RNA分子能夠根據(jù)不同的規(guī)則和需求進行自我組裝，從而形成超大分子。他們假設，這種策略也能夠將自然存在的RNA分子組裝成高度有序的環(huán)形復合物，通過將特定分子連接在一起的方式，對柔性進行限制。許多RNA以復雜但可預測的方式折疊，在小片段之間進行堿基配對交互。其結果往往會將穩(wěn)定的 "核心 "和 "莖環(huán) "向圓環(huán)外側凸出。

「在我們的方法中，我們構建了吻式發(fā)夾，可以將同一RNA兩個拷貝的不同外圍莖環(huán)連接起來，使之形成一個整體穩(wěn)定的環(huán)，其中包含了目的RNA的多個拷貝。我們推測，這些高階環(huán)可以通過冷凍電鏡進行高分辨率結構解析，該技術已首次成功應用于RNA分子的結構解析?！?/p>

—劉迪，第一作者

描繪穩(wěn)定的RNA

在冷凍電鏡方法中，許多生物大分子的單一顆粒在低溫下被瞬間凍結，以阻止它們的運動。隨后，在電子顯微鏡和計算算法的幫助下，對顆粒各個方向的二維表面投影進行比較，以重建其三維結構，實現(xiàn)生物大分子的可視化。彭和劉與廖和他的前研究生弗朗索瓦·塞洛(Fran?ois Thélot)博士合作進行了該工作，后者是該研究的另一位第一作者。廖和他的團隊在冷凍電鏡領域、以及對特定蛋白質形成的單顆粒的實驗和計算分析中做出了重要貢獻。

廖茂富說:「與傳統(tǒng)方法相比，冷凍電鏡在解析包括蛋白質、DNA和RNA在內(nèi)的生物分子的高分辨率結構細節(jié)方面有很大的優(yōu)勢，但是大多數(shù)RNA的小分子量和高柔性使其結構難以解析。我們組裝RNA多聚體的新方法同時解決了這兩個問題，通過增加RNA的分子量，并降低其柔性，我們的方法為基于冷凍電鏡方法解析RNA結構這一領域打開了大門?！褂捎谡狭薘NA納米技術和冷凍電鏡方法，該團隊將這一復合技術命名為"ROCK" (RNA oligomerization-enabled cryo-EM via installing kissing loops, 通過吻式發(fā)夾實現(xiàn)RNA寡聚化后冷凍電鏡結構解析)。

為了證實ROCK技術的可行性，該團隊將研究聚焦于四膜蟲(一種單細胞生物)的大內(nèi)含子RNA和固氮弧菌(一種固氮細菌)的小內(nèi)含子RNA，以及FMN核糖開關。內(nèi)含子RNA是散布在新轉錄RNA序列中的非編碼RNA序列，必須被 "剪接"出來才能形成成熟RNA。FMN核糖開關存在于一些細菌RNA中，這些細菌會參與由維生素B2衍生的黃素代謝物的生物合成。在與RNA結合后，黃素單核苷酸(FMN)將切換其三維構象，并抑制其母RNA的合成。

研究小組稱，他們將四膜蟲 I 組內(nèi)含子組裝成一個環(huán)狀結構，使樣品更加均勻，并能夠利用組裝結構的對稱性來進行計算。雖然數(shù)據(jù)采集兩的規(guī)模并不大，但ROCK技術的優(yōu)勢使研究小組能夠以前所未有的分辨率解析該結構。RNA的核心結構以2.85?的分辨率解析，揭示了核苷酸堿基和糖骨架結構的詳細特征。研究小組還稱如果沒有ROCK技術加持，在當前的資源條件下，他們不可能做到這一點。

冷凍電鏡還能夠捕捉不同構象的分子。研究小組通過將ROCK方法應用于固氮弧菌內(nèi)含子RNA和FMN核糖開關結構解析中，確定了固氮弧菌內(nèi)含子在其自我剪切過程中的不同構象，揭示了FMN核糖開關配體結合部位的相對剛性的構象。

這項研究生動演示了RNA納米技術如何推動著其他學科的發(fā)展。將天然狀態(tài)的RNA分子結構進行可視化，對理解不同細胞類型、組織和生物體的生物及病理過程產(chǎn)生巨大的影響，甚至能夠實現(xiàn)新的藥物開發(fā)方法。

相關文獻摘要

高分辨率的結構研究對于理解各種RNA的折疊和功能至關重要。在此，我們提出了一種納米結構工程策略，利用單顆粒冷凍電鏡(cryo-EM)對純RNA結構進行高效的結構測定。即ROCK技術(通過安裝吻式發(fā)夾實現(xiàn)RNA寡聚化的冷凍電鏡技術): 將吻式發(fā)夾序列安裝到RNA的非必要功能莖上，使其自組裝成具有多倍分子量和降低結構柔性的同源封閉環(huán)。ROCK技術能夠以2.98 ?的整體分辨率(核心部分為2.85 ?)對四膜蟲 I 組內(nèi)含子進行冷凍電鏡三維重構，以建立完整的RNA模型，包括以前未知的外圍域。ROCK技術被進一步地應用于兩個較小的RNA:?固氮弧菌 I 組內(nèi)含子和FMN核糖開關，揭示了前者的構象變化和后者的結合配體。ROCK技術有望大大促進冷凍電鏡在RNA結構研究中的應用。

評論來源：Science Daily

https://www.news-medical.net/news/20220503/New-method-enables-the-structural-analysis-of-RNA-molecules.aspx

文獻來源：Nature Methods

https://www.nature.com/articles/s41592-022-01455-w#citeas

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