獲取與骨肉瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的凋亡相關(guān)DEmRNA

RNA-seq 數(shù)據(jù)從GSE21257下載，其中包括 34 名轉(zhuǎn)移性患者和 19 名非轉(zhuǎn)移性患者。共篩選出217個(gè)與骨肉瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的下調(diào)DEmRNA和247個(gè)上調(diào)DEmRNA。從 MSigDB 的標(biāo)志基因集中下載了 161 個(gè)凋亡相關(guān)基因，然后與之前獲得的 DEmRNA 相交。最終，鑒定出 9 個(gè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的 DEmRNA

細(xì)胞凋亡相關(guān)預(yù)后特征的構(gòu)建

通過(guò)單變量和多變量 cox 回歸分析，應(yīng)用先前獲得的 9 個(gè) DEmRNA 構(gòu)建細(xì)胞凋亡相關(guān)的預(yù)后特征。在單變量 Cox 回歸分析中，四個(gè)基因被確定為預(yù)后相關(guān)基因。隨后，通過(guò)多元cox回歸分析對(duì)這些基因進(jìn)行探索，并篩選出其中兩個(gè)來(lái)建立基因特征。根據(jù)基因的回歸系數(shù)和表達(dá)水平構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式：

Riskscore=(0.44*HSPB1)+(?0.34*IER3)

接下來(lái)，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中值將所有患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。熱圖顯示，熱休克蛋白家族 B 成員 1（HSPB1）在高危組中增加，而立即早期反應(yīng) 3（IER3）則表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。同時(shí)，高危患者的預(yù)后比低危組更差。最后，建立了隨時(shí)間變化的ROC曲線。1 年、3 年和 5 年 ROC 圖的曲線下面積 (AUC) 分別為 0.75、0.74 和 0.71，這表明這種凋亡相關(guān)預(yù)后特征的穩(wěn)健性。

細(xì)胞凋亡相關(guān)預(yù)后特征的驗(yàn)證

該基因簽名的可靠性在GSE39055中得到了驗(yàn)證。37 名具有綜合預(yù)后信息的骨肉瘤患者參與了后續(xù)分析。根據(jù)之前的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式，18名患者被分為低風(fēng)險(xiǎn)組，其余19名患者被視為高風(fēng)險(xiǎn)組。HSPB1和IER3的表達(dá)傾向與GSE21257相似。風(fēng)險(xiǎn)圖和KM生存分析也表明低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與更好的預(yù)后相關(guān)。此外，時(shí)間依賴性 ROC 曲線表明基因特征是可靠的。

臨床變量與細(xì)胞凋亡相關(guān)預(yù)后特征之間關(guān)系的研究

應(yīng)用單變量和多變量 Cox 回歸分析來(lái)研究細(xì)胞凋亡相關(guān)特征和臨床變量之間的預(yù)測(cè)關(guān)系。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分別被確定為GSE21257（HR = 2.48，95% CI = 1.44–4.26，P??= 0.0010）和GSE39055（HR = 4.69，95% CI = 1.05–20.85，P??= 0.042）的獨(dú)立預(yù)后因素。更重要的是，轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的患者比沒(méi)有轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的患者具有更高的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。

然后探討臨床參數(shù)與特征中的個(gè)體基因之間的相關(guān)性。在GSE21257中，HSPB1和IER3的表達(dá)與診斷年齡或性別無(wú)關(guān)。相反，這兩個(gè)基因與轉(zhuǎn)移和細(xì)胞凋亡相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。GSE39055中也獲得了類似的結(jié)果，只是 HSPB1 與患者的復(fù)發(fā)狀態(tài)不相關(guān)

列線圖的構(gòu)建

為了準(zhǔn)確估計(jì)骨肉瘤患者的預(yù)后，根據(jù)臨床變量和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分建立列線圖。列線圖評(píng)分與患者 3 年或 5 年生存率之間的關(guān)系顯示在圖。3 年和 5 年校準(zhǔn)曲線顯示列線圖的高度可預(yù)測(cè)性，C 指數(shù)值（0.86 和 0.95）表明列線圖是可靠的

細(xì)胞凋亡相關(guān)預(yù)后特征的基因集富集分析

為了確定與細(xì)胞凋亡風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的失調(diào)途徑，進(jìn)行了 GSEA。結(jié)果顯示，在GSE21257和GSE39055中，高?；颊甙橛性S多免疫功能下調(diào)，例如自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、B細(xì)胞受體信號(hào)通路和IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)。這些結(jié)果表明細(xì)胞凋亡與免疫系統(tǒng)之間可能存在潛在的密切關(guān)系。

細(xì)胞凋亡與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性探討

通過(guò)CIBERSORT算法評(píng)估骨肉瘤中22種免疫細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)狀態(tài)。具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的骨肉瘤免疫細(xì)胞。這些細(xì)胞之間的相互關(guān)系顯示在圖然后在ssGSEA分析中進(jìn)行了細(xì)胞凋亡相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)和免疫浸潤(rùn)之間的具體關(guān)系。有趣的是， GSE21257中幾乎所有免疫細(xì)胞 (14) 和功能 (13) 均失調(diào)。同時(shí)， GSE39055中兩種免疫細(xì)胞和四種免疫功能存在差異表達(dá)。重疊的項(xiàng)目包括一種免疫細(xì)胞（Th1細(xì)胞）和四種免疫功能（CCR、Check-point、MHC I類和T細(xì)胞共抑制），而MHC I類表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)并被刪除。

骨肉瘤樣本中凋亡相關(guān)基因的驗(yàn)證

我們篩選出瑞金醫(yī)院病理診斷為骨肉瘤的8例患者，將其分為非轉(zhuǎn)移組（4例）和轉(zhuǎn)移組（4例）。然后通過(guò) IHC 檢測(cè)驗(yàn)證人骨肉瘤樣本中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，HSPB1 在非轉(zhuǎn)移患者中下調(diào)，而 IER3 顯示相反的趨勢(shì)?？傊覀冏R(shí)別并驗(yàn)證了與骨肉瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞凋亡相關(guān)的預(yù)后特征。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)這個(gè)特征與骨肉瘤的免疫浸潤(rùn)有關(guān)。該基因特征可以作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的生物標(biāo)志物，并可能為臨床治療提供新的治療靶點(diǎn)。應(yīng)該進(jìn)行進(jìn)一步的研究和臨床試驗(yàn)來(lái)闡明我們研究結(jié)果的具體機(jī)制。