研究基因功能的生物醫(yī)學(xué)小白在課題最開始往往都是從構(gòu)建一些必要的載體入手。那面對(duì)眼花繚亂的載體list（無(wú)論是Addgene還是公司）小白們更是無(wú)從下手。讀完本文，一夜之間讓你成為載體構(gòu)建的“老司機(jī)”。

大體來(lái)說(shuō)，我們研究功能無(wú)非就是在體外（in vitro）和體內(nèi)（in vivo）兩種實(shí)驗(yàn)體系中對(duì)我們的目的基因功能加以描述，如圖1所示。

圖1 基因功能研究的兩種類型。

對(duì)于體外研究中的細(xì)胞系（或者原代細(xì)胞），我們更多會(huì)選擇轉(zhuǎn)染、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或者腺病毒；而對(duì)于體內(nèi)研究，我們主要選擇購(gòu)買遺傳修飾的動(dòng)物模型，或者直接選用AAV介導(dǎo)的遺傳干預(yù)。

基因功能研究無(wú)非就是三種手段-①過(guò)表達(dá)、②敲低（減）表達(dá)、③敲除，剩余的就是檢測(cè)這三種干預(yù)手段對(duì)功能表型的定量和定性影響。

過(guò)表達(dá)

這一類型的載體選擇主要關(guān)注以下兩幾點(diǎn)：

1、啟動(dòng)子

對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，常見載體的泛表達(dá)啟動(dòng)子常見的基本就這幾個(gè)-CMV, SV40, EF1a, CAG。大部分都選擇CMV、CAG或者EF1a其中之一即可，SV40表達(dá)能力稍弱。但對(duì)于免疫細(xì)胞、干細(xì)胞我們推薦選擇EF1a即可。

比如圖2所示的載體是哺乳動(dòng)物最常用的過(guò)表達(dá)載體。（細(xì)菌、酵母、果蠅、線蟲、昆蟲、爪蟾等并不適用）

圖2 pCDNA3.1是哺乳動(dòng)物中過(guò)表達(dá)最常用的商業(yè)化載體類型。其目的基因的啟動(dòng)子是CMV。

2、標(biāo)簽

如果過(guò)表達(dá)是編碼蛋白的基因，通常我們會(huì)建議加個(gè)標(biāo)簽（Epitope tag）。其目的是給過(guò)表達(dá)的目的基因做個(gè)特殊標(biāo)記，從而有利于后續(xù)的檢測(cè)（你的過(guò)表達(dá)確定表達(dá)了么？表達(dá)量如何？）。

所以這種標(biāo)簽通常體積較小，不會(huì)影響目的蛋白的構(gòu)象、定位、功能等。比較常用的標(biāo)簽有FLAG、HA、Myc、GFP等，我們一個(gè)基因通常只需選一種即可，不過(guò)有時(shí)候這些標(biāo)簽需要多串聯(lián)幾個(gè)（比如，3′FLAG，3′HA，6′Myc等）一起增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏度。

載體構(gòu)建的時(shí)候我們的目的基因跟這些標(biāo)簽都是融合表達(dá)在一起的（通常標(biāo)簽位于目的基因的下游，也叫做（基因的）3‘端，（蛋白的）C端）（圖3），后續(xù)我們只需要購(gòu)買能特異性識(shí)別對(duì)應(yīng)標(biāo)簽的抗體做免疫印跡或者免疫熒光檢測(cè)即可。

圖3 實(shí)例：過(guò)表達(dá)基因下游帶有融合3′FLAG的載體

3、選擇標(biāo)記

選擇標(biāo)記（Selectable Markers）主要目的是區(qū)分表達(dá)與非表達(dá)目的基因的細(xì)胞。

常見的選擇標(biāo)記有Puromycin、Blasticidin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin和各種熒光蛋白如ZsGreen、EGFP、RFP、mCherry等。

Puromycin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin是一類可以用對(duì)應(yīng)的小分子藥物篩選的標(biāo)記；熒光蛋白標(biāo)記可以借助熒光顯微鏡直觀的觀察到表達(dá)目的基因的細(xì)胞，也可以直觀的估計(jì)感染效率等。

所以，原則是如果允許，Puromycin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin中的一種其中一個(gè)，比如puromycin（最常用），和熒光蛋白標(biāo)記中的任選一個(gè)，比如ZsGreen（最常用）等。實(shí)例如圖4所示。

圖4 實(shí)例。此過(guò)表達(dá)載體帶有綠色熒光蛋白ZsGreen和Puromycin雙重標(biāo)記。

敲低（減、降）表達(dá)

這類載體的選擇要簡(jiǎn)單很多，啟動(dòng)子選擇U6即可。但標(biāo)記選擇通常跟過(guò)表達(dá)類似，盡量選Puromycin和ZsGreen，如圖5所示。

圖5 帶有ZsGreen和Blasticidin（BSD）雙重標(biāo)記的敲減型載體。

敲除載體

目前最常用的就是CRISPR-Cas9的基因敲除載體，該系統(tǒng)是個(gè)二元結(jié)構(gòu)，需要在同一個(gè)細(xì)胞中一起表達(dá)Cas9和針對(duì)目的基因的sgRNA。目前所用的載體有二合一的，也有分開兩個(gè)載體的。我們優(yōu)先推薦二合一型載體。

此類型的載體也是U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的載體，由于Cas9體積過(guò)大，通常這類二合一載體僅會(huì)帶有一個(gè)標(biāo)記，如Puromycin或GFP，但也有人用同時(shí)帶有兩個(gè)標(biāo)記的載體。如圖6所示。

圖6 基于CRISPR-Cas9的基因敲除載體。我們發(fā)現(xiàn)該載體帶有ZsGreen標(biāo)記。同時(shí)Cas9C端融合FLAG標(biāo)簽。

?

注意

1、對(duì)于腺病毒載體，由于其感染效率極高，通常只需要帶熒光蛋白單個(gè)標(biāo)記即可，但推薦編碼蛋白的目的基因過(guò)表達(dá)時(shí)帶常見標(biāo)簽融合表達(dá)；
2、對(duì)于在體基因功能研究，我們常用AAV載體，這類載體我們往往只需要待單個(gè)熒光蛋白標(biāo)記即可，但推薦編碼蛋白的目的基因過(guò)表達(dá)時(shí)帶常見標(biāo)簽融合表達(dá)。

?

讀完上文，是不是已經(jīng)很清楚自己要什么樣的載體了呢，那就快來(lái)找漢恒構(gòu)建質(zhì)粒吧~

?