前言

2022年，復(fù)旦大學(xué)上海市第五人民醫(yī)院創(chuàng)傷急危重癥醫(yī)學(xué)科唐建國(guó)教授課題組在Frontiers in Cellular and Infection Microbiology期刊發(fā)表的題為“Diallyl Disulfide (DADS) Ameliorates Intestinal Candida albicans Infection by Modulating the Gut microbiota and Metabolites and Providing Intestinal Protection in Mice”的研究成果，通過糞便微生物16S rRNA測(cè)序和糞便LC-MS代謝組學(xué)研究方法，發(fā)現(xiàn)了DADS 顯著減輕了 DSS 誘導(dǎo)下腸道白色念珠菌感染，并改變了小鼠腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝特征，探究了DADS 可以調(diào)節(jié)腸道微生物群和代謝物并保護(hù)腸道屏障的內(nèi)在機(jī)理，為治療白色念珠菌感染提供了理論依據(jù)。

中文標(biāo)題：二烯丙基二硫化物(DADS)通過調(diào)節(jié)腸道微生物群和代謝物來保護(hù)小鼠腸道及改善白色念珠菌感染

研究對(duì)象：小鼠糞便

發(fā)表期刊：Frontiers in Cellular and Infection Microbiology

影響因子：5.293

發(fā)表時(shí)間：2022 年 1 月 7 日

合作單位：復(fù)旦大學(xué)上海市第五人民醫(yī)院創(chuàng)傷急危重癥醫(yī)學(xué)科

運(yùn)用生物技術(shù)：糞便代謝組分析（由鹿明生物提供技術(shù)支持）、微生物16S rRNA測(cè)序

研究背景

白色念珠菌是人類最常見的病原體，是人體腸道微生物群的正常組成部分。腸道屏障受損在腸道菌群失調(diào)和真菌病中也起著重要作用。因此，了解和預(yù)防與白色念珠菌感染相關(guān)的疾病具有重要意義。越來越多的研究表明，腸道微生物群、代謝物和腸道屏障可能影響白色念珠菌的侵襲。研究表明，炎癥性腸病(IBD)與結(jié)腸內(nèi)微生物和代謝環(huán)境的變化有關(guān)，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、影響抗生素的活性，腸道細(xì)菌產(chǎn)生的一些代謝物可以調(diào)節(jié)腸上皮和免疫功能，然而很少有研究人員將腸道微生物群的研究與腸道白色念珠菌感染期間糞便代謝物變化的研究結(jié)合起來。

大蒜作為一種日常食用的食物，也是一種由來已久的常用中藥。大蒜中的有效成分是二烯丙基二硫醚(DADS)，又稱大蒜素，具有抗真菌、抗菌、抗腫瘤等作用，可改善心血管疾病，然而，涉及DADS治療腸源性白色念珠菌感染的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)尚未見報(bào)道，治療機(jī)制是否涉及腸道菌群，代謝物和腸道屏障尚未研究。本研究通過DSS誘導(dǎo)腸道破壞建立更能代表人體腸源性白念珠菌感染的動(dòng)物模型，探索 DADS 治療的機(jī)制。

研究思路

研究結(jié)果

在DSS小鼠模型中誘導(dǎo)腸道白色念珠菌感染

作者評(píng)估了 DADS 是否可以在腸道白色念珠菌感染性小鼠模型中發(fā)揮抗真菌和抗炎作用（圖 1）。在用 3% DSS 處理并用白色念珠菌重復(fù)灌胃后，糞便白色念珠菌水平維持在 104 CFU/g 糞便（圖 1A、B）。隨后作者用三種濃度的 DADS 處理感染的小鼠：6、20 和 40 mg/kg（圖 1C）進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖1 |動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖

a)動(dòng)物模型中白色念珠菌感染的示意圖

b)糞便中的真菌負(fù)擔(dān)

c)比較不同濃度DADS作用的實(shí)驗(yàn)示意圖。使用 METABRIC 數(shù)據(jù)集使用 CTR1 或 SLC31A1 表達(dá)的患者存活率

不同濃度 DADS 對(duì)白念珠菌感染小鼠的影響

通過評(píng)估存活率、結(jié)腸長(zhǎng)度和疾病活動(dòng)指數(shù)，確定 20 mg/kg DADS 的劑量適合后續(xù)實(shí)驗(yàn)組（圖2）。75只雌性小鼠隨機(jī)分為五組：對(duì)照組、DSS、CA + DSS（6 mg/kg）、CA + DSS + DADS（20 mg/kg）和DSS + DADS（40 mg/kg）。治療十五天后，收集所有小鼠的糞便并儲(chǔ)存在-80°C。通過眶后穿刺采血，然后通過頸脫位處死小鼠并收獲它們的結(jié)腸和脾臟。

圖2 | 不同濃度 DADS 對(duì)白念珠菌感染小鼠的影響生存研究

a)結(jié)腸長(zhǎng)度

b)結(jié)腸長(zhǎng)度相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析

c)各組動(dòng)物的疾病活動(dòng)指數(shù)

DSS 誘導(dǎo)的腸道白色念珠菌感染通過 20 mg/kg DADS 在小鼠中得到緩解

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，20 mg/kg 被認(rèn)為是以下實(shí)驗(yàn)分組的最佳DADS 濃度（圖 3A）。以DSS誘導(dǎo)結(jié)腸損傷的小鼠為模型對(duì)照組(DSS)，以DSS+DADS治療的小鼠為實(shí)驗(yàn)組。雖然施用 DSS 和白色念珠菌顯著降低了小鼠的體重和存活率，但 DADS 治療減輕了這些影響（圖 3B、C）。此外，與 CA + DSS 組相比，DADS 治療導(dǎo)致糞便白色念珠菌的負(fù)荷顯著降低（圖 3D，E）。這些數(shù)據(jù)表明，與 6 mg/kg 相比，20 mg/kg DADS 治療可以更好地緩解 DSS 誘導(dǎo)的小鼠腸道白色念珠菌感染。至于 40 mg/kg DADS，則沒有改善。

圖3 | DADS 減輕了白色念珠菌感染小鼠的癥狀

a)白色念珠菌灌胃感染和 20 mg/kg DADS 給藥示意圖

b)體重變化

c)生存研究

d)糞便中的真菌負(fù)擔(dān)

e)糞便中的真菌負(fù)擔(dān)

?DADS 在感染白色念珠菌的小鼠中表現(xiàn)出抗炎作用

脾臟大小可以反映小鼠的炎癥。DSS 和白色念珠菌增加了脾臟/體重比，DADS 顯著改善了這一點(diǎn)（圖 4A、B）。此外，作者使用 ELISA 來量化促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，即 IL-6 和 IFN-γ。值得注意的是，DSS 和白色念珠菌導(dǎo)致血清和結(jié)腸中 IL-6 和 IFN-γ 的顯著增加，這些變化可以通過 DADS 治療逆轉(zhuǎn)（圖 4C、D）。為了研究 DADS 對(duì)腸道炎癥的影響，比較各組之間的結(jié)腸長(zhǎng)度和組織學(xué)變化。與上述結(jié)果一致，DADS 改善了在用 DSS 和白色念珠菌治療的小鼠中觀察到的結(jié)腸縮短（圖 5A、B)。

圖4 | DADS 在感染白色念珠菌的小鼠中表現(xiàn)出抗炎作用

a)脾臟大小和脾臟/體重比

b)脾臟/體重比

c)結(jié)腸中 IL-6 和 IFN-γ 的濃度

d)血清中 IL-6 和 IFN-γ 的濃度

DADS 保護(hù)了白色念珠菌感染小鼠的上皮屏障。

組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，白念珠菌感染小鼠的黏膜腺體部分喪失，黏膜下層和肌肉層侵蝕，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增加，DADS 可緩解這種情況（圖 5C、D）。還通過量化血清中的 FITC 含量來評(píng)估對(duì)腸道的損傷，這表明 DADS 可以改善 DSS 和 CA + DADS 組中增加的通透性（圖 5E）。此外，還定量分析了結(jié)腸中緊密連接蛋白Claudin-1和Occludin的表達(dá)水平；這些蛋白質(zhì)在腸道白色念珠菌中顯著減少感染小鼠并在 CA + DSS + DADS 組中得到改善（圖 5F，G ）。這些數(shù)據(jù)表明，DADS治療可以改善DSS和白色念珠菌對(duì)腸道屏障的損害。

圖5 | DADS 保護(hù)了白色念珠菌感染小鼠的上皮屏障

a)結(jié)腸長(zhǎng)度

b)結(jié)腸長(zhǎng)度相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析

c)結(jié)腸病理變化的H&E染色

d)結(jié)腸病理變化相關(guān)評(píng)分

e)血清中的 FITC 水平

f)緊密連接蛋白的水平

g)緊密連接蛋白的水平統(tǒng)計(jì)

DADS 改變了 DSS 誘導(dǎo)的腸道白色念珠菌感染小鼠的腸道微生物群落組成

PCA 顯示白色念珠菌、DSS 和 DADS 治療誘導(dǎo)了腸道微生物群組成的變化。此外，來自 DSS 和 CA + DSS 組的糞便樣本以高度相似性聚集在一起，但在 DADS 處理的小鼠中，來自 CA + DSS + DADS 組的樣本與對(duì)照樣本聚集在一起（圖 6A）。PCA 還區(qū)分了 CA + DSS 和 CA + DSS + DADS 組，這表明這些腸道微生物群落存在顯著差異（圖 6B）。如圖 3C、D所示，作者確定了組間屬水平前 15 種細(xì)菌的相對(duì)豐度。擬桿菌屬、大腸桿菌-志賀氏菌屬、Lachnospiraceae_ NK4A136_group、Parabacteroides等在所有組中都表現(xiàn)出較高的相對(duì)豐度。與白色念珠菌感染的小鼠相比，DADS 治療組的大腸桿菌-志賀氏菌和副桿菌屬的相對(duì)豐度降低。

關(guān)鍵細(xì)菌通過熱圖可視化并通過 Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析（圖 7A、B）。在門水平上，與腸道白色念珠菌感染組相比，DADS 治療與 Proteobacteria 豐度降低（P = 0.019，圖 7C）和 Tenericutes 豐度增加（P = 0.002，圖 7D ）相關(guān)（P < 0.05）（圖 7A）。如圖 7B所示，在屬水平上，大腸桿菌-志賀氏菌（P = 0.014，圖 7E）、糞桿菌（P = 0.027，圖 7F）、副擬桿菌（P = 0.001，圖 7G）和鏈球菌（P = 0.023，圖 7H）顯著下降，而普氏菌科_NK3B31_group（P = 0.002，圖 7I）、瘤胃梭菌（P = 0.023，圖 7J） 、瘤胃球菌科_UCG -013（P = 0.002，圖 7K ) 和顫桿菌 ( P = 0.038，圖 7L ) 在 DADS 處理的小鼠中富集。

圖6 | DADS 改變了白色念珠菌感染小鼠的腸道微生物群落組成

a)主成分分析

b)CA + DSS 和 CA + DSS + DADS 組主成分分析

c)組間屬水平前 15 種細(xì)菌的相對(duì)豐度

圖6 | 關(guān)鍵細(xì)菌體現(xiàn)

a)門水平的關(guān)鍵細(xì)菌熱圖

b)屬水平的關(guān)鍵細(xì)菌熱圖

c)Proteobacteria相對(duì)豐度

d)Tenericutes 相對(duì)豐度

e)Escherichia–Shigella相對(duì)豐度

f)Faecalibacterium相對(duì)豐度

g)Parabacteroides相對(duì)豐度

h)Streptococcus相對(duì)豐度?

i)Prevotellaceae_NK3B31_group 相對(duì)豐度

j)Ruminiclostridium 相對(duì)豐度

k)Ruminococcaceae_UCG的相對(duì)豐度

l)Oscillibacter相對(duì)豐度

?DADS 改善了 DSS 誘導(dǎo)的腸道白色念珠菌感染小鼠的糞便代謝物譜

代謝變化與腸道微生物群的改變密切相關(guān)，也被認(rèn)為是腸道炎癥的重要標(biāo)志。因此，作者進(jìn)行了 LC-MS 非靶代謝分析以檢測(cè)組間差異表達(dá)的代謝物和相關(guān)的關(guān)鍵代謝途徑。在五組中的 30 個(gè)糞便樣本中共鑒定出 8,689 種代謝物。PCA 散點(diǎn)圖顯示了聚集的 QC 樣品，這表明代謝組學(xué)分析的質(zhì)量很高（圖 8A）。

作者使用二維 PCA、PLS-DA 和 OPLS-DA 分析進(jìn)一步確定了 CA + DSS 和 20 mg/kg DADS 治療組之間代謝特征的差異（圖 8B-D）. 接下來，為了識(shí)別關(guān)鍵代謝物，作者在熱圖上可視化了前 50 種代謝物，并確定了在白色念珠菌感染小鼠和 DADS 治療小鼠之間顯著差異表達(dá)的 19 種代謝途徑（P < 0.05，圖 8E，F(xiàn)）。

此外，作者確定了 17 種重要的代謝物，以便在兩組之間進(jìn)行進(jìn)一步分析。所有與色氨酸代謝相關(guān)的差異表達(dá)代謝物在 DADS 組中均上調(diào)，包括 4-(2-氨基苯基)-2,4-二氧代丁酸、犬尿酸、N-乙酰靛紅、5-羥基吲哚乙酸、喹啉-4,8-二醇, 4-(2-amino-3-hydroxyphenyl)-2,4-dioxobutanoic acid, 3-methyldioxyindole, 和 2-formaminobenzoylacetate。與感染白色念珠菌的小鼠相比，DADS 治療的小鼠中的一些代謝物，如 PGB2、PGD2、TXA2 和脂氧素 A4 的水平升高。此外，膽汁分泌途徑的一些代謝物在 DADS 治療的小鼠中處于較高水平，包括脫氧膽酸、石膽酸、鵝去氧膽酸和膽酸。

圖7?| DADS 對(duì)白色念珠菌感染小鼠糞便代謝物的影響

a)所有組PCA

b)CA+DSS+DADS和CD+DSS組PCA

c)PLS-DA 模型

d)OPLS-DA 模型

e)兩組之間差異改變的代謝物的熱圖

f)氣泡圖中顯示的差異代謝途徑

相關(guān)討論

腸道白色念珠菌的定植和侵襲通常是播散性白色念珠菌感染的先決條件。迄今為止，雖然許多研究報(bào)道腸道微生物群、代謝物和腸道白色念珠菌可以相互作用，但缺乏全面的研究，因?yàn)槟c道菌群和代謝物的具體變化以及調(diào)節(jié)機(jī)制在腸道白念珠菌感染因干預(yù)措施。本研究主要探討了DADS（俗稱大蒜素）對(duì)DSS誘導(dǎo)的腸源性白色念珠菌感染小鼠腸道菌群、代謝物和腸道屏障的影響。結(jié)果表明，DADS 可通過增加腸道緊密連接蛋白的表達(dá)，減少腸道炎癥（反映在存活率、體重變化、結(jié)腸長(zhǎng)度變化、DAI 評(píng)分和H&E 評(píng)分）并降低血清和結(jié)腸中炎癥因子的表達(dá)。此外，DADS 改善了腸道白色念珠菌感染小鼠的腸道微生物群和腸道代謝物譜，并增加了有益細(xì)菌的表達(dá)以及相關(guān)膽汁酸和氨基酸的表達(dá)。

小鹿推薦

文章通過建立DSS 誘導(dǎo)的腸道白色念珠菌小鼠模型，模擬人類腸道真菌感染。一方面證實(shí)了白色念珠菌可以增強(qiáng) DSS 結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度，另一方面通過微生物組學(xué)和代謝組學(xué)等手段確認(rèn)了 DADS 治療可以改善腸道生態(tài)失調(diào)（改變腸道微生物群和代謝物）、腸道通透性和全身炎癥反應(yīng)。深入了解 DADS 治療的效果可能會(huì)為腸道白色念珠菌感染提供新的治療策略。

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